Sự phát sinh phôi soma

 Hai giai đoạn của sự thu nhận phôi soma

Phôi soma là phôi được tạo từ tế bào soma (tế bào sinh dưỡng, 2n), theo con đường sinh phôi soma. Trong sự sinh phôi soma, tế bào soma đóng vai trò sinh phôi như hợp tử, và sự phát triển phôi cũng qua các giai đoạn như trong sự sinh phôi hợp tử. Sự hiện diện của phôi soma là điểm kết thúc của của một chuỗi các bước bao gồm sự thu nhận các tế bào có khả năng phát sinh phôi và sự biệt hóa tế bào [124].

Sự phát sinh phôi soma thường được xem là con đường trung tâm của sự vi nhân giống thực vật, và có vai trò đặc biệt quan trọng trong các nghiên cứu về phát sinh hình thái thực vật. Sự thu nhận phôi soma thường bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn tạo các tế bào sinh phôi (trong mô sẹo và dịch treo tế bào) và giai đoạn tiến hóa phôi soma từ các tế bào sinh phôi. Dưới các điều kiện xác định, các tế bào mô sẹo hay dịch treo tế bào có thể cho các sơ khởi cơ quan (sinh cơ quan) hay phôi (sinh phôi soma) dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật [19], [22].

 Sự tạo mô sẹo

Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan. Do đó, các phần non của cơ thể thực vật (mô phân sinh ngọn, thân, rễ,…) dễ cho mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của một auxin mạnh (như 2,4- D) được áp dụng riêng rẽ hay kết hợp với auxin khác hay với cytokinin. Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo [51], [128].

Nói chung, sự tạo mô sẹo in vitro thuộc một trong ba quá trình: sự phản phân hóa của tế bào nhu mô (xung quanh mộc hay libe, trong vỏ hay lõi), sự phân chia của tế bào tượng tầng hay sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi. Để tạo mô sẹo, cần chú ý đến tuổi của mô cấy, sự dùng auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng độ auxin [17], [51], [63], [124].

 Sự tạo dịch treo tế bào

Dịch treo tế bào là dịch chứa các tế bào cô lập và các nhóm nhỏ tế bào phân tán và di chuyển trong một môi trường lỏng di động, thường được khởi phát bằng cách đặt mô sẹo vào môi trường lỏng được lắc. Giống như đối với mô sẹo, môi trường tạo dịch treo tế bào có một hay vài loại auxin (thường ở nồng độ thấp hơn so với sự nuôi cấy mô sẹo trên môi trường đặc), kết hợp với cytokinin hay không [17], [129].

Dịch treo tế bào lý tưởng có sự phân chia tế bào tích cực, sự cân bằng tốt giữa hai quá trình tạo nhóm và tách rời tế bào và có tính đồng nhất cao về hình thái và sinh hóa. Dịch treo tế bào lý tưởng là một dịch mịn, hầu như chỉ bao gồm các tế bào có khả năng sinh phôi, cô lập hay họp lại thành từng nhóm nhỏ chứa từ vài đến vài chục tế bào [17], [26], [51].

 Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển phôi soma

Đặc tính hình thái căn bản của tế bào sinh phôi rất giống với tế bào của mô phân sinh cấp một (mô phân sinh ngọc): kích thước nhỏ, hình cầu với tế bào chất đậm đặc, nhân to, lượng protein dự trữ lớn và một vài hạt tinh bột. Tuy nhiên, về mặt phát sinh hình thái, có sự khác biệt: tế bào sinh phôi cho phôi, còn tế bào mô phân sinh cho mô và cơ quan [21], [26], [51], [49].

Sự phân hóa cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi soma bắt đầu ở giai đoạn phôi hình cầu, với sự xuất hiện của tiền bì (protoderm), lớp ngoài thật sự của phôi, đặc trưng bởi sự phân chia thẳng góc. Tiền bì có vai trò tạo hình dạng phôi do hoạt động như một tác nhân lý học đối với các tế bào bên trong, và do khả năng điều hòa sự phân chia và biệt hóa tế bào trong phôi thật sự [142]. Nhận định này được củng cố vì phôi cà rốt với biểu bì bất thường không tiếp tục phát triển bình thường [119]. Sự hình thành mô phân sinh ngọn thường bắt đầu vào cuối giai đoạn phôi hình cầu và cấu trúc của mô phân sinh ngọn có thể được thấy rõ ở giai đoạn tử diệp. Ở cà rốt, phôi soma chuyển đổi thành công (hình thành các sơ khởi lá) khi không có sự không bào hóa và sự hiện diện của các khoảng gian bào ở các tế bào mô phân sinh ngọn chồi. Sự kéo dài của các tế bào bên trong phôi cà rốt đánh dấu sự biệt hóa của tiền tượng tầng. Có rất ít thông tin về sự hình thành và duy trì mô phân sinh ngọn rễ trong trường hợp phôi soma [142].

Tương tự như ở phôi hợp tử, ở phôi soma, các tử diệp có nguồn gốc từ các tế bào ở vùng ngoại biên của phôi tạo nên phôi hình tim. Số tử diệp của phôi hợp tử thường cố định, trong khi số tử diệp của phôi soma có thể thay đổi rất lớn. Tử diệp là yếu tố quan trọng trong sự điều hòa dòng auxin, làm thay đổi gradient sinh lý

trong phôi và thúc nhanh quá trình nảy mầm. Sự phát triển mô phân sinh ngọn chồi và rễ trong sự sinh phôi soma có ít công trình nghiên cứu hơn so với sự sinh phôi hợp tử [29], [124].

 Sự chọn lựa môi trường nuôi cấy cho sự phát sinh phôi soma

Nhiều yếu tố môi trường có thể ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển của mô cấy như tính chất lý học (lỏng, bán lỏng hay đặc) và pH của môi trường nuôi cấy, độ ẩm, ánh sáng và nhiệt độ trong phòng tăng trưởng [51]. Stress thẩm thấu do nồng độ đường trong môi trường có thể làm gia tăng khả năng phát sinh phôi. Mối liên hệ trực tiếp giữa mật độ tế bào có khả năng phát sinh phôi trong dịch treo tế bào và mức độ trưởng thành của phôi đã được quan sát, tuy nhiên điều kiện môi trường hay sự bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật hay các acid amin có thể tác động đến mật độ thấp ban đầu. Các cụm tế bào cà rốt có thể được duy trì trong môi trường không hormone ở điều kiện pH thấp, nhưng sự phát triển phôi xảy ra ở pH 6-7 [115].

Môi trường phổ biến nhất trong sinh phôi soma là môi trường MS [89] hay các môi trường MS cải biến [45]. Mặc dù sucrose là nguồn carbon được sử dụng thường nhất, việc bổ sung glucose cần thiết cho sự hình thành tế bào có khả năng sinh phôi ở đậu. Galactose và lactose cần trong sự nuôi cấy phôi tâm ở họ cam quýt [74]. Mặt khác, sucrose và auxin tác động lẫn nhau ở những nồng độ tối ưu [51].

Tầm quan trọng của đạm dạng NH4

+

được ghi nhận đầu tiên bởi Halperin vào

năm 1966 [60]. Theo Wetherall và Dougal, khi bổ sung NH4Cl ở nồng độ thấp (0,1

mM) cùng với nitrat ở nồng độ cố định làm gia tăng khả năng phát sinh phôi cà rốt.

Thông thường, môi trường cần tối thiểu 5-12 mM NH4

+

cho sự phát sinh phôi soma; nồng độ cao ức chế sự tạo phôi ở Cercis canadensis [131], [140].

Các acid amin cũng là nguồn nitrogen. Alanin (5-10 mM) góp phần làm gia tăng quá trình phát triển phôi (không cần trong quá trình cảm ứng tạo phôi) ở cà rốt. Prolin giúp gia tăng số lượng phôi ở cỏ linh lăng với điều kiện có NH4

+

trong môi trường. Tầm quan trọng của nitrogen trong suốt quá trình phát sinh phôi phản ánh

sự cần thiết của nitrogen cho quá trình tổng hợp protein, acid nucleic và các chất cần thiết khác xảy ra liên tục. Tuy nhiên, các ảnh hưởng này cần phải kết hợp với việc duy trì một pH thích hợp [9], [29].

 Sự dùng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự thu nhận phôi soma

Trong giai đoạn tạo tế bào sinh phôi, sự dùng một auxin mạnh (như 2,4-D 0,5 - 27,6 M) là điều cần thiết. Trong giai đoạn tiến hóa phôi, việc giảm hay loại auxin trong môi trường nuôi cấy là nguyên tắc để thu nhận phôi soma [75], [76]. Một số loài như đậu, cỏ linh lăng, keo gai và một vài loài cây gỗ như hồ đào cần auxin trong vài ngày đầu để khởi phát sự phát sinh phôi trong môi trường không hormone. Sự nuôi cấy hoa loa kèn cần 2,4-D 12 tuần trước khi chuyển sang môi trường có pH thấp và không có chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh [29]. Trong suốt quá trình phát triển phôi soma, 46% loài không cần chất điều hòa tăng trưởng thực vật, 38% cần IAA hoặc NAA kết hợp với cytokinin ở nồng độ thấp [45].

Sự di chuyển hữu cực của auxin từ trên xuống theo một trục thẳng góc với bề mặt môi trường nuôi cấy cần cho sự hình thành hệ thống mạch và phát sinh cơ quan phôi [21], [39], [45], [75], [76][146].

Nhân tố quan trọng nhất trong sự thu nhận phôi soma là auxin, nhưng có sự tác động tương hỗ giữa auxin với nitrogen khử. Các nuôi cấy phôi cà rốt có thể được duy trì ở trạng thái phát sinh phôi (tiền phôi hay các cụm phôi) trong môi trường có bổ sung 2,4-D 50-200 M tùy vào hàm lượng nitrogen khử có trong môi trường.

Các chất điều hòa tăng trưởng khác với auxin và cytokinin được sử dụng trong

một số trường hợp. Để tạo phôi soma, cần có sự cân bằng giữa ABA, zeatin và GA3

ở cây carum, hay 2-iP và GA3 ở nho. Ở cà rốt, GA3 không ảnh hưởng đến số lượng phôi được tạo thành trong giai đoạn hình cầu nhưng làm giảm số phôi ở giai đoạn hình tim và hình cá đuối [29].

 Các yếu tố khác trong sự phát sinh cơ quan và phôi soma

Hàm lượng oxygen trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật, đặc biệt đối với các nuôi cấy được thực hiện trong môi trường lỏng. Số lượng chồi con cao hơn nhiều trong trường hợp được cung cấp đầy đủ oxygen. Tốc độ tăng trưởng của các tế bào có khả năng phát sinh phôi trong dịch treo tế bào gia tăng khi lượng oxygen hòa tan trong môi trường tăng và ngược lại. Sự chết tế bào xảy ra khi nồng độ oxygen giảm xuống dưới nồng độ tới hạn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, sự thiếu oxygen ở một mức độ giới hạn cần thiết cho sự phát sinh cơ quan và phôi soma. Ở lúa mì, sự giảm hàm lượng oxygen khắc phục được tình trạng hình thành phôi bất thường và nảy mầm sớm, làm tăng tỉ lệ phôi nảy mầm thành cây con [50].

Ngoài các yếu tố trên, mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy, stress thẩm thấu, tuổi và trạng thái sinh lý của mô cấy cũng có vai trò quan trọng trong sự phát sinh cơ quan và phôi soma. Ở cà rốt, mật độ tế bào cao (100.000 tế bào/ml) cần cho sự thành lập các nhóm tế bào có khả năng sinh phôi trong khi mật độ tế bào thấp (20.000 tế bào/ml) kích thích sự phát triển phôi. Mối liên hệ trực tiếp giữa mật độ tế bào có khả năng phát sinh phôi và mức độ trưởng thành của phôi đã được quan sát, tuy nhiên điều kiện môi trường hay sự bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật hay các acid amin có thể tác động đến mật độ thấp ban đầu [17], [29].

1.7. Sự dùng dịch treo tế bào để cô lập và nuôi cấy tế bào trần

Tế bào trần là tế bào thực vật bị loại bỏ vách. Đó là các tế bào tự do, cô lập, không định hướng vì không còn chịu sự tương quan trong hệ thống thực vật. Sự cô lập tế bào trần được thực hiện nhờ xử lý vật liệu thực vật (lá, mô sẹo, dịch treo tế bào,…) với các enzyme phân hủy vách (cellulase, hemicellulase, pectolyase). Sức trương của tế bào thường được cân bằng bởi sức ép cơ học của vách. Do đó, khi loại bỏ vách, sự dùng các chất gây co nguyên sinh (CaCl2, KCl, manitol, sorbitol) trong dung dịch enzyme thay thế sức ép của vách, giúp tế bào trần được phóng thích không bị vỡ. Sau sự thủy

giải, tế bào trần được lọc qua rây (kích thước lỗ 25-56 µm), rửa sạch với một dung dịch nhiều ion, và treo trong một môi trường giàu vitamin [17], [59].

Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào trần (lỏng hay đặc) thường có auxin và cytokinin để giúp tái tạo vách và các phân chia đầu tiên của tế bào. Mật độ tế bào trần (trong dung dịch giàu vitamin, trước khi đặt trên môi trường đặc) thường trong khoảng 30.000 đến 80.000 tế bào trần/ml, nhưng cũng có thể rất cao 5 x 105–106 tế bào trần/ml. Ở đơn tử diệp, kỹ thuật “lớp nuôi” đôi khi được áp dụng, bằng cách vùi các tế bào “nuôi” từ một dịch treo tế bào tăng trưởng mạnh vào trong một môi trường bán lỏng (có chứa auxin để giúp các tế bào nuôi tăng trưởng). Sự phát triển của tế bào trần thường được theo dõi theo thời gian, dưới kính hiển vi huỳnh quang, sau sự nhuộm với phẩm nhuộm phát huỳnh quang (Fluorescein di-acetate 0,01% để khảo sát tính sống, Calcofluor để theo dõi sự thành lập vách, 4,6-diamino-2-phenilindol để chứng minh sự hiện diện của nhân) [147], [36], [55], [59].

Tế bào trần có khả năng tái tạo vách và cho phôi soma. Sự nuôi cấy tế bào trần mở ra mô hình hấp dẫn để theo dõi quá trình sinh phôi soma từ một tế bào cô lập, đặc biệt sự đặt các vi sợi cellulose để xác định hướng kéo dài của tế bào, trong các giai đoạn phát triển đầu tiên của thực vật. Tế bào trần rất thuận tiện cho việc nghiên cứu về sinh lý tế bào: tính thấm của màng, vận chuyển các chất hòa tan hay ion, cơ chế hoạt động của hormone thực vật, quang hợp, phát sinh hình thái tế bào,… Tế bào trần có thể chịu các xử lý gây đột biến và được dùng để tạo các dòng tế bào có nguồn gốc đơn bào. Ngoài ra, tế bào trần còn là vật liệu cần thiết cho sự lai soma (dung hợp tế bào trần) và áp dụng các kỹ thuật chuyển gene (hóa thẩm, điện thẩm,…) [17], [37], [59], [67].

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT QUẢ

3.1. Sự hình thành và phát triển chồi

3.1.1. Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển chồi

Mô phân sinh ngọn chồi của cây chuối bao gồm ba vùng: vùng trung tâm, vùng ngoại vi và vùng mô phân sinh lõi như được thấy ở lát cắt dọc qua mô phân sinh ngọn chồi của chuối Cau Mẵn (hình 3.1 và 3.2). Các tế bào của mô phân sinh ngọn này nói chung đang ở trạng thái phân chia và chưa phân hóa về mặt hình thái, có kích thước nhỏ, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân to, hạch nhân đậm màu… Dưới ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh (môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l; BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l), bên cạnh kiểu phát sinh hình thái thông thường (hình thành thân và lá), có sự thay đổi hình dạng của mô phân sinh ngọn chồi đồng thời với sự phân chia tế bào mạnh mẽ ở vùng bên (hình 3.3 - 3.6) và sự hình thành vùng tế bào mô phân sinh mới để phát triển các chồi mới (hình 3.7). Sự hình thành vùng mô phân sinh mới có thể xảy ra ở vùng nách lá hay biểu bì của thân và lá (hình 3.8 - 3.10).

Các quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt (TEM) cho thấy mô phân sinh ngọn chồi ở chuối chia thành hai lớp, L1 và L2 (hình 3.11). Các tế bào của lớp L1 có nhân to, hạt tinh bột và không bào nhỏ hơn so với các tế bào của lớp L2 (hình 3.12A và 3.12B). Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* với IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l, các hạt tinh bột và không bào ở các tế bào của lớp L2 trở nên nhỏ hơn so với ở các tế bào lớp L1 (hình 3.12C và 3.12D). Đặc biệt, sự phân chia tế bào ở lớp L2 của vùng ngoại vi trở nên song song với bề mặt của mô phân sinh ngọn, trong khi trên môi trường CHP* (không có chất điều hòa tăng trưởng thực vật) sự phân chia này xảy ra một cách ngẫu nhiên (hình 3.13 và 3.14).

Trong trường hợp mẫu cấy hoa đực nonchuối Hột, sự phát sinh chồi trên môi trường MS có bổ sung IAA 0,17 mg/l và BA 2,5 mg/l xảy ra ở tế bào biểu bì của phần gốc cuống hoa hoa đực non sau 3 tuần nuôi cấy (hình 3.15 - 3.17). Đây là sự tạo mới chồi, khởi đầu bởi sự thành lập các trung tâm mô phân sinh ngọn chồi (hình 3.18), sau đó các trung tâm mô phân sinh ngọn chồi này tiếp tục phát triển để cho