Ảnh hưởng của TIBA trong sự hình thành phôi
Các xử lý TIBA (chất cản sự di chuyển hữu cực của auxin) liên tục (từ ngày 0) ở các nồng độ 1,0 và 2,5 mg/l ức chế gần như hoàn toàn khả năng sinh phôi của tế bào (bảng 24, hình 3.76 - 3.78). Các xử lý vào giai đoạn tế bào đã có sự phân cực (ngày 14) ức chế rất mạnh sự sinh phôi (số phôi hình cầu sau 21 ngày xử lý giảm đáng kể). Các xử lý vào giai đoạn phôi hình cầu (ngày 28) làm giảm số phôi hình cầu và ức chế gần như hoàn toàn sự phát triển phôi, các phôi không thể đạt đến trạng thái núi lửa (bảng 24).
Bảng 24. Vai trò của TIBA trong sự phát sinh phôi sau 21 ngày nuôi cấy tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn ở các thời điểm phát triển phôi khác nhau trên môi trường Ma*
3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l và TIBA ở các nồng độ thay đổi.
Nồng độ TIBA (mg/l)
Thời điểm xử lý (ngày)
Số phôi ở ngày 21
Phôi hình cầu Phôi hình núi lửa
0,0* 0 523,33 40,96 d 0,00 0,00 b 14 832,00 49,16 bc 0,00 0,00 b 28 1018,00 113,26 a 126,67 13,87 a 1,0 0 48,00 6,43 e 0,00 0,00 b 14 170,00 26,46 e 0,00 0,00 b 28 904,00 108,30 bc 5,33 1,86 b 2,5 0 0,00 0,00 e 0,00 0,00 b 14 32,00 5,29 e 0,00 0,00 b 28 813,00 67,00 c 0,00 0,00 b
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Hình 3.76 - 3.78.Các nhóm tế bào sau 21 ngày nuôi cấy tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn
ở ờ ể ể ôi phát triển ờ * với
kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l) trên môi tr ờng Ma * với kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l và TIBA 1 mg/l.
Các nhóm tế bào ở ầ ở ờ ể ờ sau khi xử ý với môi tr ờ *, không hormone).
Các nhóm tế bào ở ầ ở ờ ể ngày 14 của quá trình phát sinh phôi. Các nhóm tế bào ở ầ ở ờ ể ngày 28 của quá trình phát sinh phôi.
các th i đi m phát tri n phôi khác nhau (ph
kh i đ u
kh i đ u th i đi m kh i đ u th i đi m
trên môi trư ng Ma ư th i đi m ngày 0 (5 gi l ư ng Ma 3 3 3 3.76. 3.77. 3.78. 3.76 3.77 3.78 2mm 3mm 3mm
Ảnh hưởng của TIBA trong sự phát sinh cơ quan phôi (sự trưởng thành của phôi)
TIBA 1 mg/l ức chế hoàn toàn sự phát triển phôi khi xử lý ở giai đoạn hình cầu. Hiệu ứng ức chế giảm khi xử lý ở giai đoạn phôi hình núi lửa và kim tự tháp (bảng 25). Với xử lý ở giai đoạn phôi hình núi lửa, sự phát triển của lá bị ức chế dẫn đến sự hình thành một vòng tròn xung quanh mô phân sinh ngọn chồi (hình 3.79A). Với xử lý ở giai đoạn phôi hình kim tự tháp, đa số các phôi không có sự phát triển rễ, phần gốc phôi bị phù to ra, và lá phát triển không bình thường (hình 3.79B - 3.79D).
Bảng 25. Tác động của TIBA trên phôi chuối Cau Mẵn ở các giai đoạn phát triển
khác nhau (được thu nhận trên môi trường Ma*
3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l) sau 42 ngày nuôi cấy trên môi trường MS½ với BA 0,227 mg/l, IAA 1,5 mg/l và TIBA 1 mg/l).
Nồng độ TIBA (mg/l)
Trạng thái phôi khi nuôi cấy Phôi trưởng thành (%) 0* Hình cầu muộn 5,00 2,88 c Hình núi lửa 66,67 8,82 a Hình kim tự tháp 73,33 6,67 a 1 Hình cầu muộn 0,00 0,00 c Hình núi lửa 13,33 3,33 c Hình kim tự tháp 33,33 8,82 b
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05 *Đối chứng: Môi trườngMS½ với BA 0,227 mg/l, IAA 1,5 mg/l
Như vậy, chất cản sự di chuyển hữu cực của auxin (cản sự phân phối bình thường của auxin trong phôi) đã gây xáo trộn mạnh sự phát triển bình thường của phôi.
Hình 3.79.
(A), (B), (C),
Phôi phát triển từ phôi giai đoạn hình núi lửa sau 6 tuần nuôi cấy. kim tự tháp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
8 Phôi phát triển từ phôi giai
Phôi phát triển từ phôi giai kim tự tháp
đoạn sau 6 tuần nuôi cấy. đoạn sau tuần nuôi cấy.
(D),
Sự phát triển phôi từ các phôi chuố ẵ ở ạ ể
ợ ậ ờ * với kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l) ờ với BA 0,227 mg/l, IAA 1,5 mg/l và TIBA 1 mg/l.
i Cau M n các giai đo n phát tri n khác nhau (đư c thu nh n trên môi trư ng Ma
trên môi trư ng
3
MS½
Phôi với tử diệp không phát triển từphôi giai đo nạ kim tự tháp sau 8 tuần nuôi cấy.
A B
C D
500 mm 500 mm
3.4.8. Sự thay đổi hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình phát triển phôi trong quá trình phát triển phôi
Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thay đổi tùy vào từng giai đoạn của sự phát triển phôi (bảng 26):
- Sau 5 giờ đặt tế bào dịch treo lên môi trường tạo phôi Ma*3 (không hormone), hàm lượng IAA, zeatin và ABA đều giảm mạnh (so với hàm lượng trong tế bào dịch treo, trước khi đặt trên môi trường tạo phôi).
- Sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l, khi tế bào chuẩn bị phân chia trước sự phát triển phôi, IAA vẫn thấp nhưng zeatin tăng mạnh.
- Sau 21 ngày nuôi cấy, tương ứng với thời điểm một số ít phôi phát triển đến giai đoạn hình cầu sớm, IAA gia tăng trở lại nhưng zeatin giảm.
- Sau 35 ngày nuôi cấy, khi phôi phát triển đến giai đoạn hình cầu muộn (với sự thành lập vùng trung tâm mô phân sinh ngọn của phôi), IAA đạt tới đỉnh và zeatin tăng mạnh.
- Sau 56 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma*3 có bổ sungkinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l, tương ứng với thời điểm sau 14 ngày có sự hiện diện của nhiều phôi hình núi lửa, hàm lượng IAA cũng như zeatin đều giảm rất mạnh.
- ABA hiện diện ở hàm lượng rất thấp, ở dạng vết (dưới 5µg/kg), trong quá trình hình thành và phát triển phôi.
- Ở phôi phát triển từ phôi hình núi lửa, sau 14 ngày cấy chuyền sang môi trường MS½ với zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l, có sự gia tăng hàm lượng zeatin đồng thời với sự tăng nhẹ hàm lượng ABA so với phôi tăng trưởng trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l(bảng 26).
Bảng 26. Sự thay đổi hàm lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật tổng cộng trong quá trình hình thành và phát triển phôi soma từ tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn có nguồn gốc cụm chồi tăng sinh cao (đo bằng phương pháp HPLC).
Thời điểm lấy mẫu (ngày)
Hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (µg/kg)
IAA Zeatin ABA
0* <5 77,9 <5 10 <5 174,9 <5 21 57,9 56,8 <5 35 118,6 215,1 <5 56 <5 27,9 <5 56*** <5 52,1 6,33
*, thời điểm tế bào được trải lên petri (sau 5 giờ xử lý với môi trường Ma*3 không có chất điều hòa tăng trưởng thực vật).
Môi trường thu nhận phôi: Ma*3 với kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l. **, Phôi phát triển từ phôi hình núi lửa sau 14 ngày cấy chuyền sang trên môi trường MS½ với zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l (phôi hình núi lửa được thu nhận sau 42 ngày nuôi cấy). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.9. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vậttrong sự phát triển phôi
Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinin trong sự phát triển phôi
Trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l (với sự hiện diện của glutamin, prolin và dịch chiết lúa mạch), các phôi không thể vượt qua giai đoạn hình kim tự tháp để nẩy mầm và phát triển thành cây. Trong khi đó, trên môi trường MS và MS ½, một lượng nhỏ phôi đã nẩy mầm (lần lượt là 11,67 1,67 % và 23,33 6,00 %). Tuy nhiên, trên hai môi trường này, chỉ có phôi ở giai đoạn núi lửa mới có khả năng hoàn tất con đường phát triển phôi và nẩy mầm (bảng 27).
Từ kết quả về sự gia tăng của IAA và zeatin trong quá trình hình thành và phát triển phôi soma (bảng 26), xử lý phối hợp BA 0,227 mg/l và IAA (1,0; 1,5 hay 2,0 mg/l) trong môi trường MS ½ giúp phôi hoàn tất con đường phát triển và nẩy mầm thành cây. Trong đó, sự phối hợp BA 0,227 mg/l và IAA 1,5 mg/l cho số lượng phôi nẩy mầm cao nhất. Sự hiện diện của IAA (1,0; 1,5 và 2,0 mg/l) làm cho cây mầm tạo mô sẹo ở phần gốc, đặc biệt khi vật liệu sử dụng ban đầu là phôi ở giai đoạn hình cầu. Đặc biệt, môi trường MS½ với zeatin 1,0 mg/l và IAA 1,5 mg/l cũng làm tăng sự phần trăm phôi nẩy mầm, dù vật liệu sử dụng ban đầu là phôi ở giai đoạn hình cầu, núi lửa, hay kim tự tháp (bảng 27).
So sánh các giai đoạn phôi được xử lý trên môi trường với BA 0,227 mg/l hay zeatin 1,0 mg/l kết hợp với IAA 1,5 mg/l, phần trăm phôi nẩy mầm luôn rất cao khi phôi được sử dụng ở giai đoạn hình kim tự tháp hay hình núi lửa, và rất thấp ở giai đoạn phôi hình cầu (bảng 27).
Phôi ở giai đoạn hình kim tự tháp có khả năng phát triển thành cây in vitro
hoàn chỉnh về hình thái với hệ thống thân, lá và rễ (hình 3.80 và 3.81). Trong khi đó, với các phôi ở giai đoạn hình núi lửa, bên cạnh một số phôi phát triển thành cây mầm, một số có sự phát sinh chồi mới (bảng 27, hình 3.82 và 3.83). Các phôi khởi đầu ở giai đoạn hình cầu có thể phát triển thành các cây mầm với lá mầm phù to ra hay quay trở lại con đường tạo mô sẹo (bảng 27, hình 3.84 và 3.85).
Trên môi trường MS½ với zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l, hệ thống mạch nhanh chóng hình thành sau 21 ngày nuôi cấy, đồng thời với sự phát triển của mô phân sinh ngọn chồi và rễ để hình thành các sơ khởi chồi và rễ sau 28 ngày nuôi cấy (hình 3.86, 3.87).
Bảng 27. Ảnh hưởng của sự phối hợp auxin và cytokinin trên sự phát triển phôi sau 42 ngày nuôi cấy các phôi chuối Cau Mẵn ở các giai đoạn phát triển khác nhau (thu nhận môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1mg/l, 2-iP 0,2 mg/l, zeatin 0,05 mg/l).
Môi trường Trạng thái phôi khi
bắt đầu nuôi cấy % phôi nẩy mầm
Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1mg/l, 2-iP 0,2mg/l và zeatin 0,05mg/l Cầu 0,00 0,00 e Núi lửa 0,00 0,00e Ma*3 (không hormone) Cầu 0,00 0,00e Núi lửa 0,00 0,00 e MS (không hormone) Cầu 0,00 0,00e Núi lửa 11,67 1,67 d MS½ (không hormone) Cầu 0,00 0,00 e Núi lửa 23,33 6,00 cd MS½ với BA 0,227mg/l và IAA 1,0mg/l Cầu 5,00 2,88 e* Núi lửa 40,00 5,77 b** MS½ với BA 0,227mg/l và IAA 1,5mg/l Cầu 5,00 2,88 e* Núi lửa 66,67 8,82 a** Kim tự tháp 73,33 6,67 a
MS½ với BA 0,227mg/l và IAA 2,0mg/l
Cầu 3,33 3,33 e* Núi lửa 36,67 8,82 bc*
MS½ với zeatin 1,0mg/l và IAA 1,5mg/l
Cầu 13,33 3,33 d* Núi lửa 70,00 5,77 a Kim tự tháp 76,67 8,82 a
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05 *, có sự xuất hiện mô sẹo; **, có sự tăng sinh chồi.
Hình 3.80.Ảnh h ởng của sự phối hợp auxin và cytokin trên sự phát triển phôi từ phôi hình kim tự tháp chuối Cau Mẵn (có nguồn gốc từ sự nuôi cấy dị ế ờ
* với kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l) sau 3 tuần (A) và 4 tuần (B) nuôi cấy trên môi tr ờng MS½ với zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l; và sau 3 tuần (C) và 4 tuần (D) nuôi cấy trên môi tr ờng MS½ với BA 0,227 mg/l và IAA 1,5 mg/l.
ư
ch treo t bào trên môi trư ng Ma ư ư 3 A B C 300 mm 800 mm 800 mm 1mm D
Hình 3.81.
(A),
(C),
(D),
Cây mầm với hệ thống lá và rễ mầm ang phát triển sau 5 tuần nuôi cấy.
Cây mầm với rễ chính ngừng t ng trưởng và rễ bên kéo dài sau 7 tuần nuôi cấy. đ
ă
(B),Cây mầm với rễ chính t ng trưởng chậm sau 6 tuần nuôi cấy.ă
Sự phát triển của cây mầm chuối Cau Mẵn từ phôi hình kim tự tháp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(có nguồn gốc từ sự nuôi cấy dị ế ờ Ma * có bổ
sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l) trên môi tr ờng
MS với zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l.
Cây mầm với ự ấ ệ ủ ễ ồ ờ ớ ễ hính ngừng t ng
tr ởng sau 7 tuần nuôi cấy.
ch treo t bào trên môi trư ng
ư s xu t hi n c a r bên đ ng th i v i r c ư 3 ½ ă B A 2mm 2mm 5mm 5mm C D
Hình 3.82-3.85. Các cây m m chu i Cau M n phát tri n t phôi các giai đo n khác nhau trên môi trư ng có b sung BA 0,227 mg/l và IAA 1,5 mg/l (phôi có ngu n g c t s nuôi c y d ch treo t bào trên môi trư ng có b sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l).
Cây m m phát tri n sau 4 tu n nuôi c y. n nuôi c y Cây m m v i ph n g c b phù Cây m m v i t di p b t thư ng ầ ố ẵ ể ừ ở ạ ờ ổ ồ ố ừ ự ấ ị ế ờ ổ
ầ ể từ phôi hình núi lửa ầ ấ Cụm chồi phát triển từ phôi hình núi lửa sau 8 tuầ ấ
ầ ớ ầ ố ị phát triển từ phôi hình cầu sau 5 tuần nuôi cấy. ầ ớ ử ệ ấ ờ phát triển từ phôi hình cầu sau 5 tuần nuôi cấy
MS Ma ½ 3* 3.82. 3.83. 3.84. 3.85. 3.82 3.83 3.84 3.85 800 mm 1mm 1mm 3mm
3.86. 3.87.
Phôi với sự hiện diện của mô phân sinh ngọn chồi và rễ sau 3 tuần nuôi cấy.
Phôi tr ởng thành với sự hiện diện của các s ởi c ồi, rễ và hệ thống mạch) sau 4 tuần nuôi cấy.
ư ơ kh ơ quan (ch
3.86 3.87
300 mm 300 mm
Hình 3.86 và 3.87.Lát cắt dọc qua phôi phát triển từ phôi hình núi lửa chuối Cau Mẵn trên môi tr ờng ½ với zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l (phôi có nguồn gốc từ sự nuôi cấy dị ế ờ * có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l) .
ư
ch treo t bào trên môi trư ng Ma
MS
Áp dụng sự phối hợp auxin, cytokinin và sự cắt một phần mô phân sinh ngọn chồi của phôi
Sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS½ có bổ sung BA 0,227 mg/l và IAA 1 mg/l, sự tăng sinh chồi từ mẫu cấy phôi trưởng thành chuối Cau Mẵn với mô phân sinh ngọn bị cắt bỏ một phần cũng như của mẫu cấy là lát cắt dọc qua mô phân sinh ngọn chồi của phôi xảy ra rất mạnh, trên 30 chồi/mẫu cấy (các phôi này phát triển trên môi trường MS½ có bổ sung zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l và có nguồn gốc từ sự nuôi cấy tế bào dịch treo trên môi trường Ma*3 có bổ sung kinetin 0,1 mg/l, 2-iP 0,2 mg/l và zeatin 0,05 mg/l) (hình 3.88 và 3.89).
3.5. Sự chuyển cây ra vườn ươm
Sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo rễ, các chồi (có nguồn gốc từ sự nuôi cấy dịch treo tế bào chuối Cau Mẵn trên môi trường MS½ với zeatin 1 mg/l và IAA 1,5 mg/l) phát triển thành cây con với hệ thống thân, lá, rễ hoàn chỉnh. Các cây con phát triển khỏe mạnh sau 2 tuần chuyển sang điều kiện phòng tăng trưởng và 4 tuần chuyển sang điều kiện nhà lưới (hình 3.90). Sau 14 tuần, các cây con sẵn sàng để chuyển sang trồng trong vườn (hình 3.91).
Hình 3.88.Cụm chồi phát triển từ phôi chuối Cau Mẵn (phôi có nguồn gốc tế bào dịch treo) bị cắt bỏ một phần mô phân sinh ngọn chồi, sau 3 tuần nuôi cấy trên môi tr ờng MSư ½có bổ sung BA 0,227 mg/l và IAA 1,5 mg/l.