Sau 15 giờ xử lý với hỗn hợp enzyme cellulase 1,5%, pectolyase 1,5% và hemicellulase 0,2%, các tế bào trần được phóng thích từ các tế bào dịch treo (có nguồn gốc từ dịch treo tế bào chuối Cau Mẵn) và các tế bào lá (có nguồn gốc từ cây
in vitro 4 tuần tuổi tăng trưởng trên môi trường MSK). Sự cô lập tế bào trần từ dịch treo tế bào cho kết quả tốt hơn (về khả năng phóng thích tế bào trần) so với sự cô lập từ lá cây in vitro (hình 3.92 và 3.94). Các tế bào trần thu nhận được từ dịch treo tế bào có kích thước tương đối đồng đều (hình 3.95) và có khả năng phát triển trên môi trường PCM với các tế bào nuôi (chuối hay cà rốt) hay N6PKM có bổ sung 2,4-D 0,2 mg/l, NAA 1 mg/l, zeatin 0,5 mg/l và sự hiện diện của các tế bào nuôi (chuối hay cà rốt) (hình 3.96 - 3.98). Sự hiện diện của các tế bào nuôi trong môi trường nuôi cấy (lớp nuôi) có vai trò kích thích sự phân chia của các tế bào trần. Sau 4 tuần nuôi cấy, sự tăng sinh của tế bào diễn ra mạnh nhất trên môi trường
N6PKM có bổ sung 2,4-D 0,2 mg/l, NAA 1 mg/l, zeatin 0,5 mg/l và tế bào nuôi cà
rốt, chậm hơn ở môi trường PCM và các tế bào nuôi chuối và chậm nhất trên môi trường PCM không có lớp nuôi (hình 3.98).
Dưới kính hiển vi huỳnh quang, sự thành lập vách được ghi nhận sau 5 ngày nuôi cấy (hình 3.99), sự phân chia đầu tiên của tế bào xảy ra sau 10 ngày và cụm tế bào với các tế bào có khả năng sinh phôi hình thành sau 4 tuần nuôi cấy (hình 3.100 - 3.102).
Dưới ảnh hưởng của PEG, các tế bào di chuyển đến tiếp xúc với nhau theo từng cặp, xếp thành hàng hay nhóm. Sự dung hợp xảy ra tại vị trí tiếp xúc giữa hai, ba hay nhiều tế bào tùy thuộc số lượng tế bào tiếp xúc với nhau (hình 3.103).
Hình 3.92 - 3.93.
3.93. Hình 3.94. Hình 3.95.
Sự phóng thích tế bào trần chuối Cau Mẵn từ các vật liệu khác nhau sau 15 giờ xử lý với hỗn hợp enzym.
Sự phóng thích tế bào trần từ lá cây .
Tập hợp tế bào trần ược cô lập từ dịch treo tế bào chuối Cau Mẵn.
Chi tiết một nhóm tế bào trần ược cô lập từ dịch treo tế bào chuối Cau Mẵn.
3.92.Sự phóng thích tế bào trần từ các nhóm tế bào dịch treo.
in vitro
đ
đ
Hình 3.96.
Hình 3.97.
Khả n ng sống của tế bào trần sau 10 ngày nuôi cấy trên môi tr ờng PCM (trắc nghiệm với TTC 1%, mũi tên chỉ sự phân chia cân xứng của tế bào trần).
Tế bào trần từ tế bào dịch treo sau 10 ngày nuôi cấy trên môi tr ờng PCM (mũi tên chỉ sự phân chia không cân xứng của tế bào trần).
ă ư ư 32mm 32mm 25mm 22mm 3.94 3.95 3.96 22mm 3.97 22mm
Hình 3.98.
(A), (B), (C),
Sự tăng trưởng của tế bào trần ược cô lập từ dịch treo tế bào chuối Cau Mẵn sau 4 tuần nuôi cấy
Trên môi trường N PKM với
đ
6
với Trên môi trư ng PCM
Trên môi trư ng PCM
ờ (không có lớp nuôi).
ờ với lớp nuôi là tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn.
2,4-D 0,2 mg/l, NAA 1 mg/l, zeatin 0,5 mg/l và lớp nuôi là tế bào dịch treo cà rốt.
Chi tiết các tế bào sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường
(D), 2,4-D 0,2 mg/l,
NAA 1 mg/l, zeatin 0,5 mg/l và lớp nuôi là tế bào dịch treo cà rốt. N PKM6 A B C D 5mm 5mm 5mm 200 mm
Hình 3.99.
Hình 3.100.
Hình 3.102.
Sự thành lập vách của tế bào trần sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường với 2,4-D 0,2 mg/l, NAA 1 mg/l và zeatin 0,5 mg/l.
Sự phân chia của tế bào trần sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PCM
Cụm tế bào hình thành từ tế bào trần sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường PCM. N PKM
với lớp nuôi là tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn.
6
Hình 3.101.
Tập hợp các tế bào trần sau 10 ngày nuôi cấy trên môi tr ờng PCM với lớp nuôi là tế bào dịch treo chuối Cau Mẵn.
ư
3.99 3.100
3.101 3.102
18 mm 18 mm
Hình 3.103 (A), (B), (C), (D), (E), (F),
. Sự dung hợp của các tế bào trần dưới ảnh hưởng của PEG Các tế bào trần tiếp xúc nhau theo cặp
Nhiều tế bào trần tiếp xúc nhau
Sự dung hợp xảy ra giữa hai tế bào trần Sự dung hợp xảy ra giữa bốn tế bào
Tế bào sau sự dung hợp giữa hai tế bào trần Tế bào sau sự dung hợp giữa nhiều tế bào.
A B C D E F 16 mm 12 mm 16 mm 12 mm 10 mm 25mm
THẢO LUẬN
Hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi và khả năng phát sinh hình thái
Vì không có một tầng phát sinh libe-mộc (mô phân sinh cấp hai) đặc trưng như ở các cây song tử diệp, nên mô phân sinh ngọn chồi (mô phân sinh cấp một) của các cây đơn tử diệp, như cây chuối, thường là vật liệu khởi đầu cho sự nuôi cấy in vitro
để nghiên cứu về sự phát sinh hình thái, bao gồm sự phát triển chồi và tạo rễ bất định từ các khúc cắt chồi, sự tạo dịch treo tế bào trực tiếp từ “cụm chồi tăng sinh cao” (cultures hautement proliférantes, scalps), và sự thu nhận phôi soma từ dịch treo tế bào hay từ tế bào trần [59], [67], [105].
Giống như ở các cây hạt kín nói chung, mô phân sinh ngọn chồi ở chuối bao gồm ba vùng: vùng trung tâm, vùng ngoại vi và vùng mô phân sinh lõi. Các tế bào mô phân sinh có đặc tính của tế bào có khả năng phát sinh cơ quan: kích thước nhỏ, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân to, hạch nhân đậm màu… Chính đặc tính này giúp tế bào phân chia mạnh, dẫn đến sự tạo các tế bào dẫn xuất có khả năng tạo cơ quan [42], [46].
Hình dạng và kích thước của mô phân sinh ngọn chồi khác nhau tùy giống chuối và thay đổi tùy theo điều kiện sống của cây. Trên các đối tượng được khảo sát, mô phân sinh ngọn chồi của các giống chuối có kiểu gen A như Cau Mẵn (AA) có kích thước (chiều cao và đường kính) lớn hơn mô phân sinh ngọn chồi của các giống có kiểu gen B như Hột (BB), dù là cây trong vườn (bảng 1) hay cây in vitro
(bảng 2). Trong cùng một kiểu gen, như Cau Mẵn (AA), mô phân sinh ngọn chồi
của các cây trồng trong vườn có kích thước lớn hơn mô phân sinh ngọn của cây in
vitro (bảng 1 và 2).
Kích thước lớn hơn của mô phân sinh ngọn chồi tương ứng với số lượng tế bào nhiều hơn. Sự kiện này liên quan tới khả năng phát triển chồi từ mô phân sinh ngọn chồi (có kích thước lớn hơn) của Cau Mẵn (AA) hay Già Cui (AAA) mạnh hơn so với mô phân sinh ngọn chồi (có kích thước nhỏ hơn) của Hột (BB) hay Mật (BBB); tương tự, khả năng phát triển chồi từ mô phân sinh ngọn chồi của cây trồng trong
vườn (có kích thước lớn hơn) mạnh hơn so với mô phân sinh ngọn chồi của cây in vitro (có kích thước nhỏ hơn) (bảng 3 và 4). Theo Nozeran [152], kích thước mô phân sinh ngọn có liên quan đến kiểu phát sinh hình thái, và qua nhiều lần cấy chuyền trong các điều kiện nuôi cấy in vitro, mô phân sinh ngọn chồi thường giảm kích thước. Chính sự giảm kích thước như vậy làm cây khoai tây in vitro không thể vượt qua trạng thái cây non, chỉ tạo các lá đơn, không thể có các lá kép như ở cây trưởng thành trong vườn.
Bình thường, các tế bào vùng ngoại vi của mô phân sinh ngọn chồi phân chia thẳng góc với bề mặt để tạo biểu bì và các lớp tế bào dưới biểu bì của thân và lá [42], [46]. Dưới tác động của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh trên các mô cấy cô lập (loại các hiệu ứng tương quan trong cây nguyên vẹn, từ rễ hay từ lá trưởng thành), bên cạnh kiểu phát sinh hình thái thông thường (cho thân và lá), còn có sự phát triển các chồi nách có sẵn ở vùng nách lá, và cả sự hình thành vùng tế bào mô phân sinh mới ở biểu bì của thân và lá để tạo các chồi mới. Sự tạo các chồi mới này liên quan tới sự tạo mới cơ quan (organ neoformation), một hiện tượng quan trọng trong vi nhân giống thực vật [50].
Các quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt cho thấy mô phân sinh ngọn chồi chuối gồm hai lớp L1 và L2 (hình 3.11). Bình thường, các tế bào của lớp L1 có nhân to, hạt tinh bột và không bào nhỏ hơn so với các tế bào của lớp L2 (hình 3.12). Tuy nhiên, sau 4 tuần nuôi cấy mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l, các hạt tinh bột và không bào ở các tế bào của lớp L2 trở nên nhỏ hơn so với ở các tế bào lớp L1. Sau đó, các tế bào lớp L2 trong vùng ngoại vi đổi hướng phân chia, trở nên song song (thay vì thẳng góc) với bề mặt của mô phân sinh ngọn (hình 3.14) để dẫn tới sự tạo chồi mới (hình 3.7). Các không bào nhỏ thường được tìm thấy trong các tế bào mô phân sinh ngọn có khả năng sinh cơ quan, và các hạt tinh bột nhỏ thường được xem như dấu hiệu của sự dùng tinh bột dự trữ cho các phản ứng biến dưỡng của tế bào trong sự phân hóa tế bào. Mặt khác, các phân chia theo một hướng xác
định là sự kiện đầu tiên trong các con đường phát sinh hình thái, bao gồm sự tạo mới chồi và phôi [17], [46], [128].
Cũng như ở các cây hạt kín khác [46], [100], [102], bên cạnh sự phân chia theo lớp, mô phân sinh ngọn chồi ở chuối cũng được phân chia theo vùng, bao gồm vùng tế bào trung tâm đặc sắc (hình 3.1, 3.11 và 3.12). Các tế bào của vùng trung tâm mô phân sinh ngọn thực vật có vai trò như các tế bào gốc (stem cells) ở động vật [48], [101], [132], không phân hóa, nhưng có khả năng tự làm mới, và là nguồn tế bào cho vùng ngoại vi (có khả năng sinh cơ quan) và vùng mô phân sinh lõi (có khả năng sinh mô) [78]. Do đó, khi dùng kim hủy mô phân sinh ngọn chồi, sự hình thành chồi chỉ xảy ra tại vị trí chồi bên, thay thế cho mô phân sinh ngọn chồi đã bị phá hủy (hình 3.21), và khi cắt bỏ một phần bề mặt của mô phân sinh ngọn chồi, các tế bào còn lại của mô phân sinh ngọn được hoạt hóa để hình thành trung tâm mô phân sinh mới (hình 3.21 và 3.22). Chính các tế bào ngoại vi, đặc biệt là các tế bào lớp L2, đã phân chia theo kiểu đặc trưng để hình thành các vùng tế bào trung tâm, dẫn đến sự hình thành chồi với số lượng lớn, tạo thành vòng chồi ngay trên bề mặt lát cắt. Sự cắt vùng trung tâm dẫn đến sự hình thành các trung tâm tổ chức mô phân sinh mới cũng được ghi nhận ở cà chua [102].
Do cách sắp xếp lần lượt (từ trên xuống) của các mô phân sinh chồi bên ở chuối, sự cắt ngang (ở mức sâu hơn) nhằm loại bỏ hoàn toàn mô phân sinh ngọn của chồi đỉnh (ở giống chuối Cau Mẵn) đã loại đi một phần mô của các mô phân sinh chồi bên. Các tế bào còn lại của mô phân sinh chồi bên bị cắt bỏ một phần này sẽ đáp ứng tương tự như các tế bào mô phân sinh còn lại trong trường hợp mô phân sinh ngọn chồi đỉnh bị cắt, dẫn đến sự xuất hiện nhiều chồi (bảng 16, hình 3.21 và 3.23).
So với các lát cắt ngang hủy phần lớn mô phân sinh ngọn chồi đỉnh, lát cắt dọc chứa các vùng trung tâm mô phân sinh ngọn (với các tế bào gốc) và vùng ngoại vi (với các lớp L1 và L2) của chồi đỉnh và chồi nách cho số chồi cao nhất sau 3 tuần nuôi cấy (bảng 16). Theo nhiều nghiên cứu, sự hiện diện của lớp L1 định hướng sự phân chia tế bào dẫn tới hình thành chồi, và sự tương quan giữa các lớp L1 và L2 có vai trò duy trì tính toàn vẹn của mô phân sinh ngọn chồi ở cà chua; mặt khác, kích
thước của mô phân sinh ngọn chồi (hậu quả của sự phân chia tế bào và tạo cơ quan ở vùng ngoại vi và sự duy trì trạng thái tế bào gốc của vùng trung tâm) được qui định bởi sự truyền tín hiệu protein của các gen được biểu hiện trong các tế bào gốc thuộc vùng trung tâm, vùng ngoại vi và vùng lõi của mô phân sinh ngọn chồi [101], [102], [130]. Do đó, có thể nói, mối tương quan giữa các lớp L1 và L2, sự hiện diện của các tế bào vùng trung tâm mô phân sinh ngọn chồi, và sự phối hợp các tín hiệu protein giữa các tế bào đóng vai trò quyết định sự hình thành các trung tâm mô phân sinh mới, và từ đó hình thành các chồi mới ở chuối.
Một vật liệu mới thích hợp và có triển vọng để tạo chồi ở chuối trong nghiên cứu này là hoa đực non, vật liệu thường được dùng để tạo mô sẹo và dịch treo tế bào [85]. Dưới ảnh hưởng của sự kết hợp IAA 0,17 mg/l và BA 2,5 mg/l hay của TDZ 2 mg/l, các tế bào biểu bì ở phần gốc của cuống hoa đực non chuối Hột phân chia và phân hóa để hình thành các vùng tế bào trung tâm mô phân sinh ngọn chồi, và từ đó phát sinh chồi tương tự như trong sự phát sinh chồi từ mô phân sinh ngọn chồi đỉnh.
Nhu cầu năng lượng, đặc tính kiểu gene và vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình phát sinh chồi
Sự phát sinh chồi đòi hỏi hoạt động sinh lý mạnh của mẫu cấy, cần nguồn năng lượng, và cường độ hô hấp là một trong những biểu hiện sinh lý của mẫu cấy trong quá trình tái lập tăng trưởng và phát triển [128]. Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l, cường độ hô hấp của chồi gia tăng rất mạnh ở tất cả các giống chuối được nuôi cấy (bảng 9, 10). Ở thời điểm này, cụm chồi phát triển rất mạnh (số chồi cũng như chiều cao chồi gia tăng), đặc biệt ở chuối Cau Mẵn (AA) (bảng 4, 5). Cũng vậy, các khúc cắt chồi từ cây trong vườn hay các giống trồng có kiểu gene A, như Cau Mẵn (AA) và Già Hương (AAA), có sự tăng sinh chồi mạnh hơn tương ứng với cường độ hô hấp cao hơn so với khúc cắt chồi từ cây in vitro hay các giống trồng có kiểu gene B, như Hột (BB) và Mật (BBB) (bảng 8, 9 và 10). Vai trò của kiểu gen trong sự phát triển
chồi ở chuối còn nhiều tranh luận [147], tuy nhiên các kết quả về sự thay đổi cường độ hô hấp được trình bày đã ủng hộ mối liên hệ này.
Trong tự nhiên, chồi ngọn đang phát triển cung cấp auxin cho cây. Sự hiện diện của auxin làm gia tăng cường độ hô hấp theo hai cách: trực tiếp huy động chất dự trữ tạo nguồn nguyên liệu cho hô hấp tế bào hay gián tiếp thông qua sự hoạt động của ethylene [37], [82], [128]. Do đó, dưới tác động của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật hiện diện trong môi trường nuôi cấy (auxin và cytokinin), cường độ hô hấp của mẫu cấy gia tăng rất mạnh, và mạnh nhất tương ứng với số lượng chồi hình thành cao nhất (bảng 6, 9 và 10).
Cùng với quá trình thoái biến các chất dự trữ, các chất biến dưỡng trung gian được sử dụng để tổng hợp các chất cần thiết cho hoạt động sống của tế bào bao gồm các hormone thực vật cần cho sự phát sinh hình thái [63], [82], [128]. Do đó, hoạt động hô hấp cao của chồi tương ứng với sự tổng hợp các chất kích thích tăng trưởng nhiều hơn, giúp cho sự biệt hóa của mô cấy xảy ra dễ dàng hơn. So với chồi chuối Hột (BB), chồi chuối Cau Mẵn (AA) có cường độ hô hấp mạnh hơn (bảng 10) tương ứng với hàm lượng auxin (IAA), zeatin và gibberellin cao hơn, và hàm lượng ABA (chất hoạt động đối nghịch với auxin và gibberellin trong sự phát triển chồi) thấp hơn (bảng 13-15). Đó là lý do các khúc cắt chồi hay khúc cắt mô phân sinh ngọn chồi chuối Cau Mẵn (AA) cho số chồi cao hơn so với các khúc cắt ở chuối Hột (BB) (bảng 10, 13, 14 và 15).
Theo Davies [37], sự hiện diện của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh quyết định sự phát sinh hình thái. Sự hiện diện và hoạt động phối hợp của cytokinin và auxin giúp cho sự gia tăng kích thước tế bào, tác động lên cả hai bước của quá trình phân chia tế bào (phân nhân và phân bào), và thúc đẩy quá trình phát sinh chồi [46], [51], [132]. Do đó, sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường CHP* có bổ sung IAA 0,17 mg/l, BA 2,5 mg/l và zeatin 1 mg/l, số chồi cũng như chiều cao chồi được cải tiến mạnh. Đồng thời với sự gia tăng số chồi và chiều cao chồi (bảng 6 và 7) là sự gia tăng hàm lượng zeatin trong chồi (có thể do tế bào tổng hợp hay do mẫu cấy hấp thu từ môi trường nuôi cấy), đặc biệt cao trong trường hợp chuối Cau Mẵn (bảng 13 - 15).