Salmonella
2.3.5.1Bảng câu hỏi khảo sát
Ngoài thông tin lâm sàng, chúng tôi còn thu thập các thông tin về thói quen ăn uống, vệ sinh và các đặc diểm kinh tế xã hội (tuổi, giới tính, thu nhập của gia đình, trình độ học vấn của cha mẹ); loại thức ăn cho bé (sữa mẹ, sữa bột,…); phương thức nuôi dạy trẻ (ở nhà hay đi nhà trẻ), nguồn thực phẩm (thức ăn mua ở chợ hay siêu thị), nguồn nước uống (nước máy, nước giếng, nước đóng chai) và các yếu tố tiếp xúc với
Dựa trên các thông tin thu thập được, chúng tôi sử dụng phần mềm Stata 11 (Statacorp, Mỹ) để tính toán các yếu tố dẫn đến nguy cơ nhiễm trùng Salmonella bằng cách so sánh nhóm bị bệnh tiêu chảy và nhóm khỏe mạnh. Chúng tôi sử dụng phương pháp hồi qui logistic để tính toán hệ số tương quan (odds ratio), OR thô và OR đã được hiệu chỉnh cho các đồng yếu tố.
Các chỉ số thống k ê :
Mối tương quan giữa việc nhiễm Salmonella và các thói quen ăn uống sinh hoạt được xác định bằng tỉ số nguy cơ. Trong đó việc người mắc bệnh và người khỏe mạnh có hay không có phơi nhiễm với một yếu tố nguy cơ (thói quen) nào đó được phân thành nhóm 1 và nhóm 2.
- Tỉ số nguy cơ (Odds ratio hay OR): là tỉ số của hai odd, thường được sử dụng trong các nghiên cứu bệnh-chứng.
Odd phản ảnh “khả năng” mắc bệnh. Odd được định nghĩa là tỉ số của hai xác suất. Nếu p là xác suất mắc bệnh, thì 1-p là xác suất sự kiện không mắc bệnh. Theo đó, odd được định nghĩa là:
odd p 1 p
OR dao động từ thấp hơn 1 đến lớn hơn 1. Nếu OR < 1, nguy cơ bị bệnh trong nhóm 1 thấp hơn trong nhóm 2 nghĩa là yếu tố nguy cơ đang quan tâm mang tính bảo vệ. Nếu OR > 1, nguy cơ bị bệnh trong nhóm 1 cao hơn nhóm 2 nghĩa là yếu tố nguy cơ đang quan tâm không mang tính bảo vệ và nếu OR = 1, không có mối liên hệ giữa yếu tố nguy cơ và bệnh.
KẾT QUẢ- BIỆN LUẬN
3.1 Tỉ lệ nhiễm trùng không triệu chứng ở trẻ em dưới 5 tuổi tại thành phố Hồ Chí Minh
Trong số 609 bệnh nhân thuộc nhóm chứng tham gia nghiên cứu, 37 trong số đó có mẫu phân dương tính với NTS, chiếm tỉ lệ 6.08%. Tỉ lệ này cao hơn nhiều tỉ lệ 1% và 2.7% trong hai nghiên cứu khác nhau trên trẻ em dưới 5 tuổi ở Hà Nội vào năm 2006 và 2007[7, 46]. Tỉ lệ này là tương đương với tỉ lệ chúng tôi quan sát được trong nghiên cứu thử nghiệm vaccine ngừa thương hàn M01ZH09 năm 2007 khi khoảng 7% trẻ tham gia nghiên cứu có mẫu phân dương tính với NTS trong vòng 1 đến 14 ngày sau khi uống[97]. Tỉ lệ này tương ứng với nghiên cứu trên trẻ em từ 2 đến 4 tuổi ở Yutacan, Mexico[79] cũng như nghiên cứu trên người nhà của bệnh nhân nhiễm trùng máu ở Kenya, Nam Phi[53]. Tuy nhiên tỉ lệ này thấp hơn rất nhiều trên những nghiên cứu mang trùng không triệu chứng ở trẻ em là con nuôi ở Pháp(47.5%)[8] và Thụy Điển (54%)[8, 92].
3.2 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng Salmonella spp phân lập từ nhóm người bệnh và nhóm người khỏe mạnh không triệu chứng bệnh và nhóm người khỏe mạnh không triệu chứng
Các chủng Salmonella phân lập từ nhóm bệnh có tỉ lệ kháng cao hơn các chủng phân lập từ nhóm mang trùng không triệu chứng, với khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0.05 ở các kháng sinh Ampicillin, Augmentin, Ceftazidime, Chloramphenicol, Gentamicin và Trimethoprim – sulfamethoxazole.
Ở nhóm chủng phân lập từ người bệnh, đa phần các chủng đều có tính kháng cao với các kháng sinh được sử dụng phổ biến trong cộng đồng như Ampicillin (64.94%), Chloramphenicol (45.45%) và Trimethoprim – sulfamethoxazole (41.56%). Tính kháng đối với các kháng sinh thuộc họ flouroquinolones như Ciprofloxacin và Oxfloxacin, hai loại kháng sinh được sử dụng chủ yếu trong điều trị tiêu chảy ở Việt Nam, vẫn còn ở mức thấp dao động từ 5.19% đến 6.49%. Điều đáng lưu ý là có đến
70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
7.79% tổng số chủng kháng với Ceftriaxone hoặc Ceftazidime, kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ 3.
Bi
ểu đồ 3.1: Tỉ lệ kháng kháng sinh của 174 chủng Salmonella
AMP AUG CAZ CHL CN CRO CIP NA OFX SXT Nhóm bệnh 64.94 16.88 7.79 45.45 22.08 7.79 5.19 28.57 6.49 41.56 Nhóm mang trùng không triệu
chứng 11.58 6.32 0.00 10.53 5.26 0 2.11 17.89 1.05 13.68
Nguyên nhân của tính kháng kháng sinh có thể do việc tự ý sử dụng kháng sinh để chữa bệnh góp phần làm tỉ lệ kháng kháng sinh tăng cao. Bởi vì việc chữa trị thường được bắt đầu trước khi có kết quả kháng sinh đồ, tình trạng kháng kháng sinh này do vậy có thể khiến việc chọn lựa kháng sinh không phù hợp để điều trị, dẫn đến đáp ứng kém với thuốc. Hoặc việc nghi ngờ vi khuẩn kháng thuốc sẽ dẫn đến việc lựa chọn một loại thuốc ít được khuyến cáo hơn (độc tính cao hơn hoặc đắt tiền hơn) trong việc điều trị các nhiễm trùng biến chứng do NTS[73].
Ở nhóm chủng phân lập được từ người mang trùng không triệu chứng, tỉ lệ kháng với hầu hết các loại kháng sinh khá thấp. Tỉ lệ kháng cao nhất thấy được là đối
với Nalidixic acid và Trimethoprim – sulfamethoxazole lần lượt là 17.89% và 13.68%. Không có chủng nào kháng với kháng sinh Ceftriaxone và Ceftazidime.
Việc các chủng NTS phân lập được từ nhóm trẻ bệnh có tính kháng kháng sinh cao hơn các chủng NTS từ nhóm mang trùng không triệu chứng có thể giải thích do những chủng kháng kháng sinh có thể có tính độc cao hơn. Trong một số trường hợp, sự thu nhận tính trạng kháng kháng sinh được hỗ trợ bởi sự thu nhận thêm gen mã hóa tính độc, chẳng hạn như những gen cần cho quá trình bám dính, xâm nhập và sản xuất toxin[73]. Sự khác biệt này còn có thể được giải thích do sự khác biệt về loại týp huyết thanh phổ biến giữa hai nhóm. Nhóm bệnh chứa nhiều Typhimurium trong khi nhóm chứng bao gồm chủ yếu Weltevreden. Đa số các nghiên cứu báo cáo tỉ lệ kháng kháng sinh cao ở Typhimurium và có rất ít chủng Weltevreden có mang tính kháng. Mỗi týp huyết thanh có phổ vật chủ riêng do đó có áp lực chọn lọc với tính kháng là khác nhau. Ví dụ như Typhimurium thường được tìm thấy trong gia súc gia cầm, là quần thể có sử dụng nhiều kháng sinh trong khi Weltevreden thường được tìm thấy trong hải sản[83].
3.3 Kết quả phân loại di truyền bằng phương pháp MLST.
3.3.1 Kết quả khuếch đại các phân đoạn gen bên trong 7 gen giữ nhà
1200bp 1000bp 500bp
trong đó có 13 kiểu kiểu trình tự mới chưa được miêu tả trước đây (1499, 1541, 1542, 1543, 1544, 1545, 1546, 1547, 1548, 1549, 1550,1561, 1562 ).
B
ả ng 3.1: Kiểu di truyền của 174 chủng Salmonella spp
Nhóm bệnh (n=79) Nhóm mang trùng không triệu chứng (n=95)
Kiểu di truyền n % Kiểu di truyền n %
34 17 21.5 365 24 25.3 19 15 19.0 1542 10 10.5 365 9 11.4 40 7 7.4 29 3 3.8 469 7 7.4 46 3 3.8 19 4 4.2 48 3 3.8 292 4 4.2 292 3 3.8 29 3 3.2 40 2 2.5 33 2 2.1 64 2 2.5 34 2 2.1 423 2 2.5 36 2 2.1 1541 2 2.5 46 2 2.1 11 1 1.3 74 2 2.1 17 1 1.3 314 2 2.1 99 1 1.3 423 2 2.1 155 1 1.3 1499 2 2.1 197 1 1.3 1546 2 2.1 203 1 1.3 11 1 1.1 214 1 1.3 22 1 1.1 359 1 1.3 31 1 1.1 413 1 1.3 50 1 1.1 469 1 1.3 82 1 1.1 516 1 1.3 155 1 1.1 1499 1 1.3 359 1 1.1 1543 1 1.3 367 1 1.1 1544 1 1.3 413 1 1.1 1545 1 1.3 430 1 1.1 1547 1 1.3 451 1 1.1 1549 1 1.3 463 1 1.1
1561 1 1.1
1562 1 1.1
Từ kết quả ST thu nhận được, chúng tôi dựa vào thông tin của chủng đi kèm với kiểu ST trên website để suy ra týp huyết thanh (bảng 3.2). Việc sử dụng bộ kháng huyết thanh để định danh các týp huyết thanh cụ thể theo phương pháp Kauffman- White là khá phức tạp, tốn kém, tốn nhiều công sức cũng như đòi hỏi nhiều kinh nghiệm. Việc dựa trên dữ liệu MLST toàn cầu phần nào giúp xác định được týp huyết thanh của hầu hết các chủng trong bộ mẫu của chúng tôi, ngoại trừ những mẫu có kiểu di truyền mới. Đa số một kiểu ST tương ứng với một týp huyết thanh, ngoại trừ ST 48, 74 và 292 có 2 týp huyết thanh khác nhau. Một số trường hợp một týp huyết thanh có nhiều kiểu ST khác nhau, ví dụ như ST 19, 34, 99 và 1544 đều là S. Typhimurium. Số lượng kiểu di truyền cũng như týp huyết thanh ở nhóm mang trùng không triệu chứng là đa dạng hơn ở nhóm bệnh (bảng 3.2)
B
ả ng 3.2: Sự phân bố các týp huyết thanh trong nhóm bệnh và nhóm mang trùng không triệu chứng
Nhóm bệnh (n=79)
Nhóm mang trùng không triệu chứng (n=95)
Týp huyết thanh n % Týp huyết thanh n %
S. Typhimurium 34 43.0 S. Weltevreden 24 25.3 S. Weltevreden 9 11.4 S. spp 20 21.1 S. spp 7 8.9 S. Typhimurium 8 8.4 S. Stanley 4 5.1 S. Derby 7 7.4 S. Albany 3 3.8 S. Rissen 7 7.4 S. Newport 3 3.8 S. Albany 4 4.2 S. Panama 3 3.8 S. Enteritidis 3 3.2 S. Anatum 2 2.5 S. Newport 3 3.2
S. Enteritidis 1 1.3 S. Braenderup 1 1.1
S. Give 1 1.3 S. Cerro var. Siegburg 1 1.1
S. Indiana 1 1.3 S. London 1 1.1 S. Litchfield 1 1.3 S. Mbandaka 1 1.1 S. London 1 1.3 S. Meleagridis 1 1.1 S. Mbandaka 1 1.3 S. Muenchen 1 1.1 S. Rissen 1 1.3 S. Pomona 1 1.1 S. Saintpaul 1 1.1 S. Virchow 1 1.1 S. Worthington 1 1.1
Theo kết quả bảng 3.2, S. Typhimurium là týp huyết thanh gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột phổ biến nhất với tỉ lệ lên đến 43%, điều này phù hợp với nhiều nghiên cứu trên thế giới khi S. Typhimurium luôn là chủng gây bệnh phổ biến ở khắp các châu lục. Riêng S. Enteritidis, týp huyết thanh thường xuyên gây dịch bệnh liên quan tới trứng gia cầm nhiễm khuẩn ở các nước phát triển như Mỹ và Canada[30] lại rất hiếm thấy trong nghiên cứu của chúng tôi. Một số týp huyết thanh khác thường gây dịch bệnh phổ biến tại các nước phát triển như S. Newport, S. Give, S. Virchow và S. Hadar cũng được phát hiện với số lượng rất ít.
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy S. Weltevreden là týp huyết thanh phổ biến nhất phân lập từ người nhiễm trùng không triệu chứng ở Việt Nam. S. Weltevreden cũng là týp huyết thanh gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột phổ biến nhất ở Thái Lan và Malaysia[3, 88]. Nghiên cứu của Thong và cộng sự cho thấy có sự tương đồng về mặt di truyền giữa chủng S. Weltevreden gây bệnh ở người và chủng phân lập được từ rau sống ở Malaysia, điều này cho thấy rau sống có thể là nguồn vật chủ cho S. Weltevreden[96]. Tuy nhiên rau sống cũng có thể bị nhiễm bẩn bởi nước và phân.
thấy týp huyết thanh này có liên quan đến nguồn nước nhiễm khuẩn.
Kết quả kết hợp nhóm huyết thanh và týp huyết thanh cho thấy Typhimurium nói riêng và các týp nhóm B nói chung thường được tìm thấy trong những chủng gây bệnh, với khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0.05) (bảng 3.3). Ngược lại, týp Weltevreden và týp thuộc nhóm khác nhóm B, C và D (không nhóm) thường được tìm thấy ở những chủng gây nhiễm trùng không triệu chứng.
B
ả ng 3.3: Nhóm huyết thanh và týp huyết thanh nổi trội ở nhóm bệnh và nhóm mang trùng không triệu chứng Nhóm huyết thanh Nhóm bệnh (n=79) Nhóm mang trùng không triệu chứng (n=95) Tổng cộng(n=174) P n % n % n % Nhóm B 44 55.7 21 22.1 65 37.4 0.004* Derby 2 2.5 7 7.4 9 5.2 0.096 Paratyphi B mono 2 2.5 2 2.1 4 2.3 1.000 Stanley 4 5.1 3 3.2 7 4.0 0.706 Typhimurium 34 43.0 8 8.4 42 24.1 <0.001* Nhóm C 10 12.7 13 13.7 23 13.2 0.532 Newport 3 3.8 3 3.2 6 3.4 1.000 Nhóm D 6 7.6 4 4.2 10 5.7 0.157 Enteritidis 1 1.3 3 3.2 4 2.3 0.317 Không nhóm 19 24.1 57 60.0 76 43.7 <0.001* Weltevreden 9 11.4 24 25.3 33 19.0 0.009*
*p<0.05, sử dụng kiểm định chi bình phương
3.3.3 Đặc điểm các gen giữ nhà.
Theo kết quả bảng 3.4, tất cả các giá trị tỉ số giữa đột biến khác nghĩa (sự thay đổi nucleotide làm thay đổi trình tự acid amin) so với đột biến đồng nghĩa (sự thay đổi nucleotide không làm thay đổi trình tự acid amin) – dN/dS đều nhỏ hơn 1 chứng tỏ 7
B
ả ng 3.4: Đặc điểm các gen giữ nhà
Nhóm bệnh
(n=79) Nhóm mang trùngkhông triệu chứng (n=95)
Genes dN dS dN/dS dN dS dN/dS aroC 0.00007 0.02426 0.003 0.00006 0.03617 0.002 dnaN 0.00232 0.03768 0.062 0.00073 0.04638 0.016 hemD 0.00830 0.00960 0.865 0.00937 0.01044 0.898 hisD 0.00202 0.04638 0.044 0.00102 0.05619 0.018 purE 0.00099 0.03517 0.028 0.00180 0.04496 0.040 sucA 0.00001 0.01746 0.001 0.00006 0.02949 0.002 thrA 0.00033 0.05036 0.007 0.00022 0.06138 0.004
3.3.4 Kết quả cây phát sinh loài
Kết quả cây phát sinh loài cho thấy quần thể Salmonella lưu hành ở khu vực thành phố Hồ Chí Minh là khá đa dạng. Chủng 174_NBN (nằm dưới cùng) thuộc phân loài diarizonae nên có khoảng cách di truyền khá xa so với toàn bộ các chủng NTS thuộc phân loài enterica còn lại (hình 3.2).
Các týp huyết thanh Salmonella khác nhau có mức tương đồng cao nhưng không đồng nhất như quan sát thấy ở S. Typhi và S. Paratyphi A. Điều này có thể giải thích do những chủng NTS có phổ vật chủ rộng hơn S. Typhi và S. Paratyphi A, là những chủng chỉ lưu hành trên người, vì vậy tính đa dạng cũng như cơ hội trao đổi vật liệu di truyền là thấp hơn hẳn Salmonella spp[56].
Týp huyết thanh Enteritidis được tìm thấy ở 2 nhánh khác nhau trên cây phát sinh loài có thể do cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên trình tự 7 gen giữ nhà, trong khi týp huyết thanh lại được qui định bởi các gen mã hóa kháng nguyên O và H.
Hình 3.2: Cây phát sinh loài của 174 chủng Salmonella spp
Màu đỏ là các chủng phân lập từ nhóm bệnh và màu xanh lá cây là các chủng phân lập từ nhóm mang trùng không triệu chứng. Màu vàng là các chủng có cùng trình tự được thu gọn lại.
diễn mối quan hệ giữa 174 chủng Salmonella phân lập ở thành phố Hồ Chí Minh, dựa vào các kiểu ST trong quần thể (Hình 3.3).
Nếu phân chia nhóm theo quy tắc những ST khác nhau không quá 2 loci trong 7 loci được xem là một nhóm thì có 4 phức hợp dòng (lineage) nổi trội và 36 kiểu trình tự đơn độc (singleton sequence type). Phức hợp dòng lớn nhất có 40 chủng, gồm ST
19, 34, 99 và 1544 (AA, AC, AD, AE), trong đó ST 19 được xem là ST gốc (ST có số lượng SLVs cao nhất). Phức hợp 2 gồm 7 chủng với ST 29 và 1550 (AH, AJ). Phức hợp 3 cũng gồm 7 chủng với các ST 74, 423 và 1545 (AF, AB, AO). Phức hợp 4 gồm 3 chủng chứa ST 64 và 1548 (AI, AK).
6 6 AS AT AX 6 6 A0 6 AH 1 AL A6 AY AJ A5 BA 7 6 6 6 6 A2 6 5 BK AK 1 5 AI BE BD 5 AR 5 5 5 BH AW AF 1 5 AB 1 AG 5 6 6 6 A1 AM 5 4 BF 4 AQ BI 6 5 5 AE 1 A4 6 AD 1 1 AC AA AO A3 6 AZ 6 5 BJ 5 6 A7 AP 6 6 6 6 BC A8 AN AU AV
Hình 3.3: Cây Minimum spanning tree được vẽ từ dữ liệu MLST của 174 mẫu
Salmonella spp
Hình 3.3 mô tả cách phân nhóm của 47 kiểu ST xác định được của các chủng
Salmonella bằng Minimum spanning tree, vẽ bằng phần mềm Bionumerics (version
5.0; Applied Maths). Mỗi ST được đại diện bởi một vòng tròn. Kích thước của mỗi vòng tròn thể hiện số lượng các chủng tạo nên kiểu ST đó. Nếu các kiểu ST có 1 hoặc 2 allele khác nhau, chúng sẽ nằm chung một nhóm, liên kết với nhau bằng đường kẻ đậm và có vòng bao quanh (ví dụ: cụm có vòng bao màu hồng gồm các nhóm AA AC AD AE). Nếu chúng khác nhau từ 3 allele trở lên, chúng sẽ được liên kết bằng đường
chủng phân lập từ nhóm mang trùng không triệu chứng có màu xanh. Vòng tròn có cả 2 màu xanh đỏ chứng tỏ kiểu ST đó được tìm thấy ở cả 2 nhóm.
Ở những nước phát triển, nhiều nghiên cứu cho rằng các trang trại chăn nuôi là