Nguyên tắc
Bộ kit QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) kết hợp ưu điểm của kỹ thuật ly tâm cột và đặc điểm bám có chọn lọc của DNA mạch đôi vào màng siclica. Những dung dịch đệm trong bộ kit được thiết kế để thu được DNA hiệu quả nhất và loại bỏ những tạp chất khác. Ở nồng độ muối cao, DNA sẽ bám vào màng silica trong khi những tạp chất khác như mồi, muối, enzyme… sẽ đi qua cột. Tạp chất được loại bỏ
● Máy ly tâm
● Eppendorf 1.5ml
● Bộ kit QIAquick bao gồm: Dung dịch rửa PE, dung dịch kết dính PBI (Guanidine hydrochloride, isopropanol), dung dịch EB (10mM Tris-Cl, pH 8.5).
Tiến hành
● Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick PCR Purification Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cho một thể tích sản phẩm PCR vào 5 thể tích của dung dịch PBI có sẵn trong eppendorf 1.5ml và trộn đều.
● Chuyển toàn bộ hỗn hợp này vào cột của bộ kit, ly tâm 13200 vòng/phút trong 1 phút. Đổ bỏ phần dịch chảy xuống ống, đặt cột trở lại vào ống.
● Thêm 0.75 ml dung dịch rửa PE vào cột, ly tâm 13200 vòng/phút trong 1 phút. Đổ bỏ phần dịch chảy xuống, đặt cột trở lại ống, ly tâm 13200 vòng/phút trong 1 phút nữa.
● Đặt cột vào một eppendorf sạch.
● Thêm 50 µl dung dịch EB vào trung tâm của màng và ly tâm 13200 vòng/phút trong vòng 1 phút. Thu phần dịch chảy xuống có chứa DNA.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đo nồng độ DNA và pha loãng với nước để có được nồng độ 40ng/µl dùng cho phản ứng giải trình tự.
Nguyên tắc giải trình tự do Sanger và cộng sự đưa ra vào năm 1977 dựa trên sự hình thành một tập hợp nhiều oligonucleotide có chiều dài khác nhau và mỗi oligonucleotide có xác suất xuất hiện bằng nhau trong phản ứng. Các trình tự này sau đó được tách ra dựa vào kích thước bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có khả năng phân tách hai trình tự chỉ khác nhau một nucleotide. Kết quả điện di được đọc bằng một máy dò tự động.
Hóa chất và dụng cụ
● Dung dịch đệm cho phản ứng PCR giải trình tự
● Dung dịch BigDye Terminator (chứa ddNTP, DNA polymerase)
● DNA mạch khuôn đã được tinh sạch và xác định nồng độ, lượng DNA mẫu phụ thuộc vào kích thước và cấu hình của DNA.
● Mồi sử dụng cho phản ứng như trình bày trong bảng 2.5
● Nước cất.
Bảng 2.5: Trình tự mồi cho phản ứng giải trình tự
Gen Trình tự mồi
aroC Mồi xuôi 5'-GGCACCAGTATTGGCCTGCT-3'
Mồi ngược 5'-CATATGCGCCACAATGTGTTG-3'
dnaN Mồi xuôi 5'-CCGATTCTCGGTAACCTGCT-3'
Mồi ngược 5'-CCATCCACCAGCTTCGAGGT-3'
hemD Mồi xuôi 5'-GTGGCCTGGAGTTTTCCACT-3'
Mồi ngược 5'-CGCGGATCGGGATTTTCCAG-3'
sucA Mồi xuôi 5'-AGCACCGAAGAGAAACGCTG-3'
Mồi ngược 5'-GGTTGTTGATAACGATACGTAC-3'
thrA Mồi xuôi 5'-ATCCCGGCCGATCACATGAT-3'
Mồi ngược 5'-CTCCAGCAGCCCCTCTTTCAG-3'
Tiến hành
Trong nghiên cứu này, chúng tôi giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động ABI 3310 (Applied Biosystem, Mỹ) sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit (Applied Biosystem, Mỹ) với các thành phần phản ứng và chương trình như bảng 2.6 và 2.7. Bảng 2.6 : Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự Thành phần Thể tích BigDye Terminator 1 µl Dung dịch đệm 3.5 µl Mồi (10 µM) 4 µl DNA khuôn (40ng/ µl) 1 µl Nước cất 10.5 µl Thể tích tổng cộng 20 µl
96oC 1 phút 1 chu kỳ
96oC 20 giây
55oC 20 giây
60oC 4 phút
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng cách tủa với Ethanol:
● Cho 4 µl dung dịch dừng phản ứng (gồm 2 µl NaOAc 1.5 M và 2 µl EDTA 50mM vào mỗi eppendorf.
● Chuyển toàn bộ sản phẩm PCR vào từng eppendorf và trộn đều.
● Thêm 60 µl ethanol 95% lạnh (-200C) vào trộn đều. Ly tâm ngay lập tức ở 13200 vòng/phút trong 15 phút ở 40C.
● Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, không chạm vào phần tủa.
● Rửa tủa DNA bằng 200 µl ethanol lạnh (-200C) 70% hai lần. Mỗi lần rửa ly tâm 13200 vòng/phút trong 2 phút ở 40C. Sau khi ly tâm, cẩn thận đổ bỏ dịch nổi.
● Sấy khô bằng máy hút chân không trong 10 phút.
● Huyền phù mẫu tủa trong 10 µl dung dịch nạp mẫu HiDi formamide (Applied Biosystem). Mẫu trước khi tiến hành giải trình tự được ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút để DNA tan hoàn toàn.
2.3.3.6 Phân tích kết quả giải trình tự
với mỗi locus). Sau đó chúng tôi nhập trình tự của mỗi allele của mỗi mẫu phân lập lên trang web MLST của Salmonella spp (http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Senterica ). Kết quả chúng tôi thu nhận về là dữ liệu về số của 7 allele tại 7 loci của mỗi mẫu phân lập.
Sau khi có dữ liệu về các allele, tiếp tục nhập dữ liệu này lên mục tìm kiểu trình tự ST (sequence type) của trang web MLST để thu được số của kiểu trình tự của mỗi mẫu phân lập, từ đó xác định týp huyết thanh dựa trên dữ liệu của chủng đi kèm kiểu trình tự đó.
2.3.3.7 Phân tích kết quả MLST
Phân tích đặc điểm các gen giữ nhà (house keeping genes)
Những đột biến trên trình tự mã hóa protein dẫn đến thay đổi trình tự acid amin được gọi là đột biến không đồng nghĩa (non synomynous substitution), trong khi những đột biến không làm thay đổi acid amin được gọi là đột biến đồng nghĩa (synomynous substitution). Tỉ lệ giữa số lượng của đột biến không đồng nghĩa (non-synomynous subtitution) trên đột biến đồng nghĩa (dN/dS) được tính toán bằng phần mềm Mega 5[94]. Tỉ số dN/dS này được sử dụng nhằm ước lượng áp lực chọn lọc trên trình tự mã hóa protein. Giá trị dN/dS lớn hơn 1 chứng tỏ có chọn lọc dương, tức là những đột biến không đồng nghĩa được ưu tiên trong quần thể. Trong khi tỉ số dN/dS=1 chứng tỏ có chọn lọc trung tính và dN/dS<1 chứng tỏ có chọn lọc âm, quần thể ưu tiên giữ lại trình tự protein gốc hơn là protein đột biến.
nhau được so sánh kiểm tra sự tương đồng sử dụng phần mềm Se_al
(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/seal/) , lưu ở định dạng PHYLIP, sau đó được đưa vào
phần mềm PHYML 3.0 [42] để dựng cây phát sinh loài, sử dụng mô hình biến đổi (substitution model) của Hasegawa-Kishino-Yano (HKY85), quá trình xây dựng cây được lặp lại 500 lần. Cây phát sinh loài sau đó được xem bằng phần mềm Fig tree
(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) và xuất ra ở định dạng JPEG.
Vẽ cây Minimum spanning tree bằng phần mềm Bionumeric 4.5
MSTREE là công cụ đồ họa cho phép liên kết các nút (node) với nhau trong một nhóm dữ liệu (dataset) sao cho tổng khoảng cách của các nhánh là nhỏ nhất. Thuật toán MST được cài đặt trong Bionumerics 4.5 được sử dụng để vẽ cây MSTREE từ số allele của tất cả các mẫu phân lập được. Thuật toán này sử dụng một kiểu di truyền (ST) có số lượng biến đổi ở một locus (single locus variants_SLVs) cao nhất làm nút gốc và dẫn xuất những ST khác từ đó. ST có từ 3 allele giống nhau trở lên được liên kết bằng đường gạch ngang.
2.3.5 Xác định các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng dạ dày ruột doSalmonella Salmonella
2.3.5.1Bảng câu hỏi khảo sát
Ngoài thông tin lâm sàng, chúng tôi còn thu thập các thông tin về thói quen ăn uống, vệ sinh và các đặc diểm kinh tế xã hội (tuổi, giới tính, thu nhập của gia đình, trình độ học vấn của cha mẹ); loại thức ăn cho bé (sữa mẹ, sữa bột,…); phương thức nuôi dạy trẻ (ở nhà hay đi nhà trẻ), nguồn thực phẩm (thức ăn mua ở chợ hay siêu thị), nguồn nước uống (nước máy, nước giếng, nước đóng chai) và các yếu tố tiếp xúc với
Dựa trên các thông tin thu thập được, chúng tôi sử dụng phần mềm Stata 11 (Statacorp, Mỹ) để tính toán các yếu tố dẫn đến nguy cơ nhiễm trùng Salmonella bằng cách so sánh nhóm bị bệnh tiêu chảy và nhóm khỏe mạnh. Chúng tôi sử dụng phương pháp hồi qui logistic để tính toán hệ số tương quan (odds ratio), OR thô và OR đã được hiệu chỉnh cho các đồng yếu tố.
Các chỉ số thống k ê :
Mối tương quan giữa việc nhiễm Salmonella và các thói quen ăn uống sinh hoạt được xác định bằng tỉ số nguy cơ. Trong đó việc người mắc bệnh và người khỏe mạnh có hay không có phơi nhiễm với một yếu tố nguy cơ (thói quen) nào đó được phân thành nhóm 1 và nhóm 2.
- Tỉ số nguy cơ (Odds ratio hay OR): là tỉ số của hai odd, thường được sử dụng trong các nghiên cứu bệnh-chứng.
Odd phản ảnh “khả năng” mắc bệnh. Odd được định nghĩa là tỉ số của hai xác suất. Nếu p là xác suất mắc bệnh, thì 1-p là xác suất sự kiện không mắc bệnh. Theo đó, odd được định nghĩa là:
odd p 1 p
OR dao động từ thấp hơn 1 đến lớn hơn 1. Nếu OR < 1, nguy cơ bị bệnh trong nhóm 1 thấp hơn trong nhóm 2 nghĩa là yếu tố nguy cơ đang quan tâm mang tính bảo vệ. Nếu OR > 1, nguy cơ bị bệnh trong nhóm 1 cao hơn nhóm 2 nghĩa là yếu tố nguy cơ đang quan tâm không mang tính bảo vệ và nếu OR = 1, không có mối liên hệ giữa yếu tố nguy cơ và bệnh.
KẾT QUẢ- BIỆN LUẬN
3.1 Tỉ lệ nhiễm trùng không triệu chứng ở trẻ em dưới 5 tuổi tại thành phố Hồ Chí Minh
Trong số 609 bệnh nhân thuộc nhóm chứng tham gia nghiên cứu, 37 trong số đó có mẫu phân dương tính với NTS, chiếm tỉ lệ 6.08%. Tỉ lệ này cao hơn nhiều tỉ lệ 1% và 2.7% trong hai nghiên cứu khác nhau trên trẻ em dưới 5 tuổi ở Hà Nội vào năm 2006 và 2007[7, 46]. Tỉ lệ này là tương đương với tỉ lệ chúng tôi quan sát được trong nghiên cứu thử nghiệm vaccine ngừa thương hàn M01ZH09 năm 2007 khi khoảng 7% trẻ tham gia nghiên cứu có mẫu phân dương tính với NTS trong vòng 1 đến 14 ngày sau khi uống[97]. Tỉ lệ này tương ứng với nghiên cứu trên trẻ em từ 2 đến 4 tuổi ở Yutacan, Mexico[79] cũng như nghiên cứu trên người nhà của bệnh nhân nhiễm trùng máu ở Kenya, Nam Phi[53]. Tuy nhiên tỉ lệ này thấp hơn rất nhiều trên những nghiên cứu mang trùng không triệu chứng ở trẻ em là con nuôi ở Pháp(47.5%)[8] và Thụy Điển (54%)[8, 92].
3.2 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng Salmonella spp phân lập từ nhóm người bệnh và nhóm người khỏe mạnh không triệu chứng bệnh và nhóm người khỏe mạnh không triệu chứng
Các chủng Salmonella phân lập từ nhóm bệnh có tỉ lệ kháng cao hơn các chủng phân lập từ nhóm mang trùng không triệu chứng, với khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0.05 ở các kháng sinh Ampicillin, Augmentin, Ceftazidime, Chloramphenicol, Gentamicin và Trimethoprim – sulfamethoxazole.
Ở nhóm chủng phân lập từ người bệnh, đa phần các chủng đều có tính kháng cao với các kháng sinh được sử dụng phổ biến trong cộng đồng như Ampicillin (64.94%), Chloramphenicol (45.45%) và Trimethoprim – sulfamethoxazole (41.56%). Tính kháng đối với các kháng sinh thuộc họ flouroquinolones như Ciprofloxacin và Oxfloxacin, hai loại kháng sinh được sử dụng chủ yếu trong điều trị tiêu chảy ở Việt Nam, vẫn còn ở mức thấp dao động từ 5.19% đến 6.49%. Điều đáng lưu ý là có đến
70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
7.79% tổng số chủng kháng với Ceftriaxone hoặc Ceftazidime, kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ 3.
Bi
ểu đồ 3.1: Tỉ lệ kháng kháng sinh của 174 chủng Salmonella
AMP AUG CAZ CHL CN CRO CIP NA OFX SXT Nhóm bệnh 64.94 16.88 7.79 45.45 22.08 7.79 5.19 28.57 6.49 41.56 Nhóm mang trùng không triệu
chứng 11.58 6.32 0.00 10.53 5.26 0 2.11 17.89 1.05 13.68
Nguyên nhân của tính kháng kháng sinh có thể do việc tự ý sử dụng kháng sinh để chữa bệnh góp phần làm tỉ lệ kháng kháng sinh tăng cao. Bởi vì việc chữa trị thường được bắt đầu trước khi có kết quả kháng sinh đồ, tình trạng kháng kháng sinh này do vậy có thể khiến việc chọn lựa kháng sinh không phù hợp để điều trị, dẫn đến đáp ứng kém với thuốc. Hoặc việc nghi ngờ vi khuẩn kháng thuốc sẽ dẫn đến việc lựa chọn một loại thuốc ít được khuyến cáo hơn (độc tính cao hơn hoặc đắt tiền hơn) trong việc điều trị các nhiễm trùng biến chứng do NTS[73].
Ở nhóm chủng phân lập được từ người mang trùng không triệu chứng, tỉ lệ kháng với hầu hết các loại kháng sinh khá thấp. Tỉ lệ kháng cao nhất thấy được là đối
với Nalidixic acid và Trimethoprim – sulfamethoxazole lần lượt là 17.89% và 13.68%. Không có chủng nào kháng với kháng sinh Ceftriaxone và Ceftazidime.
Việc các chủng NTS phân lập được từ nhóm trẻ bệnh có tính kháng kháng sinh cao hơn các chủng NTS từ nhóm mang trùng không triệu chứng có thể giải thích do những chủng kháng kháng sinh có thể có tính độc cao hơn. Trong một số trường hợp, sự thu nhận tính trạng kháng kháng sinh được hỗ trợ bởi sự thu nhận thêm gen mã hóa tính độc, chẳng hạn như những gen cần cho quá trình bám dính, xâm nhập và sản xuất toxin[73]. Sự khác biệt này còn có thể được giải thích do sự khác biệt về loại týp huyết thanh phổ biến giữa hai nhóm. Nhóm bệnh chứa nhiều Typhimurium trong khi nhóm chứng bao gồm chủ yếu Weltevreden. Đa số các nghiên cứu báo cáo tỉ lệ kháng kháng sinh cao ở Typhimurium và có rất ít chủng Weltevreden có mang tính kháng. Mỗi týp huyết thanh có phổ vật chủ riêng do đó có áp lực chọn lọc với tính kháng là khác nhau. Ví dụ như Typhimurium thường được tìm thấy trong gia súc gia cầm, là quần thể có sử dụng nhiều kháng sinh trong khi Weltevreden thường được tìm thấy trong hải sản[83].
3.3 Kết quả phân loại di truyền bằng phương pháp MLST.
3.3.1 Kết quả khuếch đại các phân đoạn gen bên trong 7 gen giữ nhà
1200bp 1000bp 500bp
trong đó có 13 kiểu kiểu trình tự mới chưa được miêu tả trước đây (1499, 1541, 1542, 1543, 1544, 1545, 1546, 1547, 1548, 1549, 1550,1561, 1562 ).
B
ả ng 3.1: Kiểu di truyền của 174 chủng Salmonella spp
Nhóm bệnh (n=79) Nhóm mang trùng không triệu chứng (n=95)
Kiểu di truyền n % Kiểu di truyền n %
34 17 21.5 365 24 25.3 19 15 19.0 1542 10 10.5 365 9 11.4 40 7 7.4 29 3 3.8 469 7 7.4 46 3 3.8 19 4 4.2 48 3 3.8 292 4 4.2 292 3 3.8 29 3 3.2 40 2 2.5 33 2 2.1 64 2 2.5 34 2 2.1 423 2 2.5 36 2 2.1 1541 2 2.5 46 2 2.1 11 1 1.3 74 2 2.1 17 1 1.3 314 2 2.1 99 1 1.3 423 2 2.1 155 1 1.3 1499 2 2.1 197 1 1.3 1546 2 2.1 203 1 1.3 11 1 1.1 214 1 1.3 22 1 1.1 359 1 1.3 31 1 1.1 413 1 1.3 50 1 1.1 469 1 1.3 82 1 1.1 516 1 1.3 155 1 1.1 1499 1 1.3 359 1 1.1 1543 1 1.3 367 1 1.1 1544 1 1.3 413 1 1.1 1545 1 1.3 430 1 1.1 1547 1 1.3 451 1 1.1 1549 1 1.3 463 1 1.1
1561 1 1.1
1562 1 1.1
Từ kết quả ST thu nhận được, chúng tôi dựa vào thông tin của chủng đi kèm với kiểu ST trên website để suy ra týp huyết thanh (bảng 3.2). Việc sử dụng bộ kháng huyết thanh để định danh các týp huyết thanh cụ thể theo phương pháp Kauffman- White là khá phức tạp, tốn kém, tốn nhiều công sức cũng như đòi hỏi nhiều kinh nghiệm. Việc dựa trên dữ liệu MLST toàn cầu phần nào giúp xác định được týp huyết thanh của hầu hết các chủng trong bộ mẫu của chúng tôi, ngoại trừ những mẫu có kiểu di truyền mới. Đa số một kiểu ST tương ứng với một týp huyết thanh, ngoại trừ ST 48, 74 và 292 có 2 týp huyết thanh khác nhau. Một số trường hợp một týp huyết thanh có nhiều kiểu ST khác nhau, ví dụ như ST 19, 34, 99 và 1544 đều là S. Typhimurium. Số lượng kiểu di truyền cũng như týp huyết thanh ở nhóm mang trùng không triệu chứng là đa dạng hơn ở nhóm bệnh (bảng 3.2)
B
ả ng 3.2: Sự phân bố các týp huyết thanh trong nhóm bệnh và nhóm mang trùng không triệu chứng
Nhóm bệnh (n=79)
Nhóm mang trùng không triệu chứng (n=95)
Týp huyết thanh n % Týp huyết thanh n %
S. Typhimurium 34 43.0 S. Weltevreden 24 25.3 S. Weltevreden 9 11.4 S. spp 20 21.1 S. spp 7 8.9 S. Typhimurium 8 8.4 S. Stanley 4 5.1 S. Derby 7 7.4 S. Albany 3 3.8 S. Rissen 7 7.4 S. Newport 3 3.8 S. Albany 4 4.2 S. Panama 3 3.8 S. Enteritidis 3 3.2 S. Anatum 2 2.5 S. Newport 3 3.2
S. Enteritidis 1 1.3 S. Braenderup 1 1.1
S. Give 1 1.3 S. Cerro var. Siegburg 1 1.1