1.5.1. Phage typing
Phage typing là phương pháp truyền thống dùng để phân biệt Typhi dựa trên khả năng ly giải vi khuẩn có kháng nguyên Vi của Vi-phage. Sau đó, phương pháp này được nhanh chóng áp dụng trên Typhimurium, sử dụng 29 loại phage để phân biệt 34 týp khác nhau[109]. Hiện nay phage typing chỉ được sử dụng để phân biệt những týp huyết thanh quan trọng của Enteritidis và Typhimurium như PT4 và DT104. Phương pháp này rất hữu ích trong việc xác định các chủng Salmonella phân lập ở những nơi khác nhau vào các thời điểm khác nhau là giống hay khác tùy vào phản ứng nhạy kháng với một hỗn hợp các phage dùng để phân loại.
Phage typing có thể phân biệt các chủng có mối quan hệ gần gũi nhưng khả năng phân biệt bị hạn chế bởi số loại phage hiện có cũng như một số chủng không thể định type bằng kĩ thuật này. Phage typing đòi hỏi việc duy trì nhiều loại bacteriophage chỉ có thể hiện diện trong các phòng thí nghiệm chuẩn. Hơn nữa, việc diễn giải kết quả
đòi hỏi kinh nghiệm nhất định. Một trong những yếu tố quan trọng của phương pháp phage typing là tính ổn định dài hạn của hỗn hợp phage.
1.5.2. Plasmid typing
Plasmid typing là phương pháp phân biệt dựa trên sự khác biệt về kiểu hình cắt giới hạn của plasmid. Các chủng vi khuẩn được phân biệt dựa trên sự hiện diện, số lượng và kích thước các phân đoạn plasmid có trong vi khuẩn sau khi được xử lý bằng enzyme cắt giới hạn và điện di trên gel agarose. Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này không phải chủng Salmonella nào cũng có mang plasmid vì vậy những chủng không mang plasmid sẽ không được phân biệt bằng phương pháp này[27]. Hơn nữa plasmid là chỉ thị di truyền không ổn định, có thể được thu nhận và mất đi, vì vậy plasmid typing không thích hợp cho các nghiên cứu về tiến hóa.
1.5.3. Ribotyping
Trong phương pháp ribotyping, DNA bộ gen được cắt bằng enzyme cắt giới hạn, phân tách bằng điện di trên gel agarose và lai với mẫu dò DNA cho gen rRNA. Mặc dù gen rRNA có tính bảo tồn cao, chúng lại được bao hai đầu bằng những vùng có kích thước khác nhau cho phép phân biệt những chủng khác nhau. Phương pháp này có độ lặp lại cao và có thể được thực hiện tự động. Ngoài ra, có thể áp dụng nhiều enzyme cắt giới hạn cùng lúc để tăng khả năng phân biệt của phương pháp. Tuy nhiên phương pháp này có mặt hạn chế trong khả năng phân biệt một số týp huyết thanh do số lượng hạn chế các gen rRNA ở một số týp huyết thanh[27].
1.5.4. PFGE
PFGE được phát triển để phân loại các mảnh DNA kích thước từ 30-2000Kb trên gel agarose để phân loại phân tử nấm Saccharomyces cerevisiae. Trong PFGE, tế bào vi khuẩn được ly giải và DNA bộ gen được cắt bằng enzyme cắt giới hạn trong các plug agar để ngăn ngừa sự đứt gãy bộ gen và những mảnh DNA được phân tách bằng
điện di trong trường xung. Phương pháp này được sử dụng để phân tích những mẫu S. Typhi rời rạc hoặc những mẫu trong trận dịch. PFGE từ đó được sử dụng rộng rãi để phát hiện và nghiên cứu các vụ nhiễm Salmonella. Nhờ vào khả năng phân loại cao so với các phương pháp truyền thống như phage typing và nhiều phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn khác, PFGE trở thành tiêu chuẩn vàng cho những nghiên cứu về dịch tễ Salmonella từ năm 2001. Dữ liệu phân tử của những PFGE profile của nhiều týp huyết thanh Salmonella khác nhau được lưu trữ bởi CDC, cho phép nhiều nhà khoa học và nhà dịch tễ học thuộc mạng lưới PFGE (PulseNet) tham khảo[110].
PFGE là phương pháp tốn nhiều công sức và thời gian cũng như cần nhiều kĩ năng để hoàn thành qui trình và diễn giải kết quả. Một số chủng có thể được xem như tương đồng khi chỉ sử dụng một enzyme cắt giới hạn, vì vậy nhiều lần chạy PFGE khác nhau với nhiều enzyme cắt giới hạn khác nhau là cần thiết để kết quả có độ phân giải cao hơn.
1.5.5. MLEE
Multi locus enzyme electrophoresis (MLEE) dùng để phân loại các chủng dựa trên khả năng di động trên gel của nhiều enzyme nội bào khác nhau. Đột biến trên những gen mã hóa cho các enzyme này sẽ dẫn đến sự thay đổi các acid amin trong cấu trúc enzyme, từ đó ảnh hưởng đến cấu hình tích điện của các enzyme và vì vậy làm thay đổi tính di động trong điện trường của chúng. Tuy nhiên, phương pháp phân loại dựa trên điện di này lại khá chủ quan trong việc diễn dịch kết quả và khó chuẩn hóa giữa các phòng thí nghiệm.
1.5.6. MLST
Multi locus sequence typing (MLST) là phương pháp được phát triển vào năm 1998 để áp dụng nguyên lý của MLEE trên trình tự DNA, ví dụ như sự phát hiện những đột biến được tích lũy chậm chạp trên các loci có chọn lọc trung tính. Những allele này được phân lập trực tiếp từ trình tự nucleotide dài từ 400 đến 600 bp của
những gen giữ nhà thay vì so sánh khả năng di động của các enzyme chuyển hóa. Trong phương pháp MLST, những gen giữ nhà được chọn nằm rải rác trên bộ gen của vi khuẩn. Một đoạn DNA có kích thước xác định của mỗi gen giữ nhà được khuếch đại và giải trình tự. Một trình tự độc nhất được gán cho 1 số allele riêng biệt và tập hợp nhiều allele khác nhau cho một kiểu di truyền (sequence type) riêng biệt. Nhiều hạn chế của phương pháp MLEE đã được giải quyết nhờ phương pháp MLST. Kết quả có độ lặp lại và dữ liệu được lưu trữ ở dạng số trên website cho phép việc trao đổi thông tin được dễ dàng giữa các phòng thí nghiệm. MLST còn có thể được thực hiện tự động với số lượng mẫu lớn. Những allele được phân lập bằng MLST đến nay nhiều hơn MLEE vì chỉ có 5% sự thay đổi về mặt di truyền làm thay đổi tính chất di động của các enzyme chuyển hóa. Giá thành giải trình tự ngày càng giảm cũng là yếu tố hỗ trợ cho kĩ thuật này. MLST đã được sử dụng để nghiên cứu về mặt tiến hóa và mối quan hệ di truyền của nhiều sinh vật gây bệnh và không gây bệnh[70]. Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi và hiện có đến 48 hệ thống MLST cho nhiều sinh vật khác nhau
(http://web.mpiib-berlin.mpg.de/mlst/ , http://pubmlst.org/ và http://www.mlst.net/ ).
Hiện có 3 hệ thống MLST đã được phát triển để nghiên cứu mối liên hệ về mặt tiến hóa giữa những chủng Salmonella spp. Hệ thống MLST phân loại Salmonella do Kotetishvili và cộng sự đưa ra vào năm 2002 dựa trên bốn gen: 16S RNA, phosphomannomutase (manB), glutamine synthetase (glnA) và 1,2-propanediol utilization factor (pduF)[59]. Hệ thống này được phát triển để nghiên cứu dịch tễ của những trận dịch do Salmonella gây ra và được cho là phân biệt tốt hơn PFGE. Tuy nhiên việc chỉ sử dụng 4 gen có thể hạn chế việc ứng dụng kỹ thuật này trên một số lượng lớn mẫu. Sau khi nghiên cứu 12 loci trên Meningococcus, 7 loci được chọn để có độ phân giải vừa đủ và kết luận đáng tin cậy[70]. Hầu hết các hệ thống MLST hiện nay đều phải dựa trên từ 6 đến 10 loci.
Hệ thống MLST khác do Sukhnannand và cộng sự phát triển năm 2005[91] gồm việc giải trình tự của 5 gen giữ nhà là panB (ketopentoate hydroxymethyltransferase),
icd (isocitrate dehydrogenase), manB (phosphomannomutase), mdh (malate
dehydrogenase), aceK (isocitrate dehydrogenase kinase/phsophatase) và 2 gen mã hóa tính độc là gen fimA (fimbrial gene A) và spaN (surface presentation of antigens N). Những kiểu di truyền đặc hiệu cho týp huyết thanh được quan sát thấy ở các chủng
enterica dưới loài khác nhau. Tuy nhiên hệ thống này lại có những hạn chế trong việc
nghiên cứu tiến hóa ở vi khuẩn Salmonella vì nó bao gồm 2 gen mã hóa cho tính độc và 2 gen này có thể chịu ảnh hưởng của chọn lọc tự nhiên.
Hệ thống MLST do Kidgell và cộng sự phát triển năm 2002[56] dựa trên 7 gen giữ nhà nằm rải rác trên bộ gen của Salmonella Typhi CT18, 7 gen này mã hóa cho những enzyme chuyển hóa vì vậy không nằm dưới áp lực chọn lọc. Hệ thống 7 gen này gồm aroC (chorismate synthase), dnaN (DNA polymerase III beta subunit), hemD (uroporphyrinogen III cosynthase), hisD (histidinol dehydrogenase), purE (phosporibosylaminoimidazole carboxylase), sucA (α-ketoglutarate dehydrogense) và
thrA (aspartokinase and homoserine dehydrogenase). Hệ thống này phù hợp với yêu cầu
của một hệ thống MLST cơ bản vì vậy được áp dụng để phân loại tất cả các chủng
Salmonella. Cây phân loại di truyền được xây dựng dựa trên trình tự 7 gen giữ nhà của
nhiều chủng Salmonella cho thấy khoảng cách tiến hóa giữa các phân loài S. enterica và S.bongori (hình 1.5).
Hình 1.5: Kết quả cây phân loại di truyền cho Salmonella enterica[28]
Cây phân loại di truyền được dựa trên trình tự của 7 gen giữ nhà. Vòng tròn màu xanh là S. enterica thuộc phân loài 1. Vòng màu vàng bao gồm S. enterica thuộc các phân loài II, IIIa, IIIb, IV và VI. Vòng màu đỏ là S. bongori hay còn gọi là phân loài V.