2.3.4.1Tách chiết DNA vi khuẩn
Chuyển một khuẩn lạc đơn Salmonella spp. vào 5 ml môi trường LB, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC với tốc độ lắc 150 vòng/phút. Dịch nuôi cấy sau đó được ly tâm ở 13200 vòng/phút trong 1 phút để thu sinh khối. DNA bộ gen của vi khuẩn được tách chiết bằng bộ kít Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Mỹ). DNA sau khi thu nhận được xác định nồng độ bằng máy đo quang phổ kế Nanodrop (Eppendorf, Đức).
Nguyên tắc tách chiết DNA bằng Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Mỹ):
Ly giải tế bào để phóng thích DNA. Ủ với RNase để loại bỏ RNA trong mẫu. Biến tính protein.
● Máy li tâm (Eppendorf, Đức).
● Tube 1.5ml.
● Bộ kít tách chiết DNA của Promega (gồm dung dịch ly giải tế bào, dung dịch RNase, dung dịch tủa protein, isopropanol và ethanol 70%, dung dịch hòa tan DNA).
Tiến hành:
● Ly giải tế bào: sau khi ly tâm dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm, sinh khối vi khuẩn được thu nhận và được hòa tan trong 600 µl dung dịch phá màng (nuclei lysis) và ủ ở 80oC trong 5 phút. Hỗn hợp sau đó được để ở nhiệt độ phòng và thêm 3 µl RNAse vào, trộn đều, và ủ ở 37oC trong 45 phút.
● Loại bỏ protein: 200 µl dung dịch tủa protein (protein precipitation) được thêm vào hỗn hợp, trộn kỹ, và ủ trên đá lạnh trong 15 phút, sau đó ly tâm ở 13200 vòng/phút trong 15 phút.
● Tủa và tinh sạch DNA: phần dịch nổi trong ống được chuyển sang một eppendorf mới có chứa 600 µl isopropanol ở nhiệt độ phòng, đảo đều nhẹ, và ly tâm ở 13200 vòng/phút trong 2 phút. Sau đó dịch nổi được loại bỏ nhằm thu kết tủa. 600 µl ethanol 70% ở nhiệt độ phòng được thêm vào, ly tâm ở 13200 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ ethanol và làm khô bằng máy quay chân không trong 10 – 15 phút.
● Dung giải DNA trong 100 µl dung dịch rehydration (đi kèm với bộ kít), ủ ở 65oC trong 60 phút và sau đó được bảo quản ở 4oC.
B
ảng 2.2: Trình tự các mồi sử dụng cho phản ứng PCR
Gen Trình tự Kích thước
aroC Mồi xuôi 5'-CCTGGCACCTCGCGCTATAC-3'
Mồi ngược 5'-CCACACACGGATCGTGGCG-3'
dnaN Mồi xuôi 5'-ATGAAATTTACCGTTGAACGTGA-3'
Mồi ngược 5'-AATTTCTCATTCGAGAGGATTGC-3'
hemDMồi xuôi 5'-ATGAGTATTCTGATCACCCG-3'
Mồi ngược 5'-GACCAATAGCCGACAGCGTAG-3'
hisD Mồi xuôi 5'-GTCGGTCTGTATATTCCCGG-3'
Mồi ngược 5'-GGTAATCGCATCCACCAAATC-3'
purE Mồi xuôi 5'-CGCATTATTCCGGCGCGTGT-3'
Mồi ngược 5'-CGCGGATCGGGATTTTCCAG-3'
sucA Mồi xuôi 5'-AGCACCGAAGAGAAACGCTG-3'
Mồi ngược 5'-GGTTGTTGATAACGATACGTAC-3'
thrA Mồi xuôi 5'-ATCCCGGCCGATCACATGAT-3'
Dung dịch đệm 10X 5 µl 1X dNTPs (20mM mỗi loại) 0.75 µl 0.3mM MgCl2 (50mM) 2 µl 2mM Mồi xuôi (10µM) 2 µl 0.4µM Mồi ngược (10µM) 2 µl 0.4µM DNA bản mẫu (50ng) 2µl 2ng/µl
Taq polymerase (5U/µl) 0.1 µl 0.5U
Nước cất vừa đủ 50µl
Bảng 2.4 : Chương trình phản ứng khuếch đại
Bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Biến tính 96oC 3 phút 1 chu kỳ
Biến tính 96 oC 15 giây
Bắt cặp 55 oC 15 giây
Kéo dài 72 oC 30 giây
Kéo dài 72 oC 5 phút 1 chu kỳ
2.3.3.3 Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose
Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Gel agarose có cấu tạo nền như tổ ong có thể phân tách các trình tự DNA
Hóa chất và dụng cụ:
● Dung dịch đệm Tris-borat/EDTA 10X (TBE): 108g Tris base, 55g acid boric, 40ml EDTA 0.5M.
● Dung dịnh đệm mang mẫu (6X) gồm 0,25% phẩm màu cam, 30% glycerol trong nước.
● 10mg/ml Ethidium bromide trong nước (2,7-diamino-10-ethyl-9- phenylphenanthridinium bromide).
● Thang DNA lamda 100 bp chuẩn (Invitrogen) với vạch thấp nhất là 100 bp, cao nhất là 2072 bp, từ vạch 100 bp đến vạch 1500 bp mỗi vạch cách nhau 100 bp (hình 2.1).
● Máy phát hiện DNA bằng tia UV (Vilber Lourmat) và hệ thống chụp hình, phân tích kết quả bằng hệ thống Gel Doc (Biorad, Mỹ). Các vạch được phân tích bằng phần mềm Quantity One (Biorad, Mỹ).
Tiến hành :
● Tạo bảng gel 2%: Cân 2g agarose hoà trong 100ml dung dịch đệm TBE, đun sôi cho agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội khoảng 50oC. Cho vào dung dịch 3µl Ethidium bromide, lắc đều và đổ gel vào khay có gắn lược tạo giếng. Gel sẽ định hình sau khoảng 30-60 phút.
● Điện di: 10µl sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được trộn với 2 µl dung dịch đệm mang mẫu có nồng độ 6X (loading buffer). Tất cả hỗn hợp được cho vào các giếng của bảng gel 2% và chạy điện di cùng với 6 µl thang DNA 100 bp (50ng/ml). Quá trình điện di được thực hiện trong 45 phút, ở điện thế 180
Volt.
● Kích thước sản phẩm DNA được phát hiện và kiểm tra bằng máy đo UV ở bước sóng 590nm trong vùng ánh sáng đỏ cam và kết quả được phân tích bằng phần mềm Quantity One.
2.3.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR
Nguyên tắc
Bộ kit QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) kết hợp ưu điểm của kỹ thuật ly tâm cột và đặc điểm bám có chọn lọc của DNA mạch đôi vào màng siclica. Những dung dịch đệm trong bộ kit được thiết kế để thu được DNA hiệu quả nhất và loại bỏ những tạp chất khác. Ở nồng độ muối cao, DNA sẽ bám vào màng silica trong khi những tạp chất khác như mồi, muối, enzyme… sẽ đi qua cột. Tạp chất được loại bỏ
● Máy ly tâm
● Eppendorf 1.5ml
● Bộ kit QIAquick bao gồm: Dung dịch rửa PE, dung dịch kết dính PBI (Guanidine hydrochloride, isopropanol), dung dịch EB (10mM Tris-Cl, pH 8.5).
Tiến hành
● Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick PCR Purification Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cho một thể tích sản phẩm PCR vào 5 thể tích của dung dịch PBI có sẵn trong eppendorf 1.5ml và trộn đều.
● Chuyển toàn bộ hỗn hợp này vào cột của bộ kit, ly tâm 13200 vòng/phút trong 1 phút. Đổ bỏ phần dịch chảy xuống ống, đặt cột trở lại vào ống.
● Thêm 0.75 ml dung dịch rửa PE vào cột, ly tâm 13200 vòng/phút trong 1 phút. Đổ bỏ phần dịch chảy xuống, đặt cột trở lại ống, ly tâm 13200 vòng/phút trong 1 phút nữa.
● Đặt cột vào một eppendorf sạch.
● Thêm 50 µl dung dịch EB vào trung tâm của màng và ly tâm 13200 vòng/phút trong vòng 1 phút. Thu phần dịch chảy xuống có chứa DNA.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đo nồng độ DNA và pha loãng với nước để có được nồng độ 40ng/µl dùng cho phản ứng giải trình tự.
Nguyên tắc giải trình tự do Sanger và cộng sự đưa ra vào năm 1977 dựa trên sự hình thành một tập hợp nhiều oligonucleotide có chiều dài khác nhau và mỗi oligonucleotide có xác suất xuất hiện bằng nhau trong phản ứng. Các trình tự này sau đó được tách ra dựa vào kích thước bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có khả năng phân tách hai trình tự chỉ khác nhau một nucleotide. Kết quả điện di được đọc bằng một máy dò tự động.
Hóa chất và dụng cụ
● Dung dịch đệm cho phản ứng PCR giải trình tự
● Dung dịch BigDye Terminator (chứa ddNTP, DNA polymerase)
● DNA mạch khuôn đã được tinh sạch và xác định nồng độ, lượng DNA mẫu phụ thuộc vào kích thước và cấu hình của DNA.
● Mồi sử dụng cho phản ứng như trình bày trong bảng 2.5
● Nước cất.
Bảng 2.5: Trình tự mồi cho phản ứng giải trình tự
Gen Trình tự mồi
aroC Mồi xuôi 5'-GGCACCAGTATTGGCCTGCT-3'
Mồi ngược 5'-CATATGCGCCACAATGTGTTG-3'
dnaN Mồi xuôi 5'-CCGATTCTCGGTAACCTGCT-3'
Mồi ngược 5'-CCATCCACCAGCTTCGAGGT-3'
hemD Mồi xuôi 5'-GTGGCCTGGAGTTTTCCACT-3'
Mồi ngược 5'-CGCGGATCGGGATTTTCCAG-3'
sucA Mồi xuôi 5'-AGCACCGAAGAGAAACGCTG-3'
Mồi ngược 5'-GGTTGTTGATAACGATACGTAC-3'
thrA Mồi xuôi 5'-ATCCCGGCCGATCACATGAT-3'
Mồi ngược 5'-CTCCAGCAGCCCCTCTTTCAG-3'
Tiến hành
Trong nghiên cứu này, chúng tôi giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động ABI 3310 (Applied Biosystem, Mỹ) sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit (Applied Biosystem, Mỹ) với các thành phần phản ứng và chương trình như bảng 2.6 và 2.7. Bảng 2.6 : Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự Thành phần Thể tích BigDye Terminator 1 µl Dung dịch đệm 3.5 µl Mồi (10 µM) 4 µl DNA khuôn (40ng/ µl) 1 µl Nước cất 10.5 µl Thể tích tổng cộng 20 µl
96oC 1 phút 1 chu kỳ
96oC 20 giây
55oC 20 giây
60oC 4 phút
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng cách tủa với Ethanol:
● Cho 4 µl dung dịch dừng phản ứng (gồm 2 µl NaOAc 1.5 M và 2 µl EDTA 50mM vào mỗi eppendorf.
● Chuyển toàn bộ sản phẩm PCR vào từng eppendorf và trộn đều.
● Thêm 60 µl ethanol 95% lạnh (-200C) vào trộn đều. Ly tâm ngay lập tức ở 13200 vòng/phút trong 15 phút ở 40C.
● Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, không chạm vào phần tủa.
● Rửa tủa DNA bằng 200 µl ethanol lạnh (-200C) 70% hai lần. Mỗi lần rửa ly tâm 13200 vòng/phút trong 2 phút ở 40C. Sau khi ly tâm, cẩn thận đổ bỏ dịch nổi.
● Sấy khô bằng máy hút chân không trong 10 phút.
● Huyền phù mẫu tủa trong 10 µl dung dịch nạp mẫu HiDi formamide (Applied Biosystem). Mẫu trước khi tiến hành giải trình tự được ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút để DNA tan hoàn toàn.
2.3.3.6 Phân tích kết quả giải trình tự
với mỗi locus). Sau đó chúng tôi nhập trình tự của mỗi allele của mỗi mẫu phân lập lên trang web MLST của Salmonella spp (http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Senterica ). Kết quả chúng tôi thu nhận về là dữ liệu về số của 7 allele tại 7 loci của mỗi mẫu phân lập.
Sau khi có dữ liệu về các allele, tiếp tục nhập dữ liệu này lên mục tìm kiểu trình tự ST (sequence type) của trang web MLST để thu được số của kiểu trình tự của mỗi mẫu phân lập, từ đó xác định týp huyết thanh dựa trên dữ liệu của chủng đi kèm kiểu trình tự đó.
2.3.3.7 Phân tích kết quả MLST
Phân tích đặc điểm các gen giữ nhà (house keeping genes)
Những đột biến trên trình tự mã hóa protein dẫn đến thay đổi trình tự acid amin được gọi là đột biến không đồng nghĩa (non synomynous substitution), trong khi những đột biến không làm thay đổi acid amin được gọi là đột biến đồng nghĩa (synomynous substitution). Tỉ lệ giữa số lượng của đột biến không đồng nghĩa (non-synomynous subtitution) trên đột biến đồng nghĩa (dN/dS) được tính toán bằng phần mềm Mega 5[94]. Tỉ số dN/dS này được sử dụng nhằm ước lượng áp lực chọn lọc trên trình tự mã hóa protein. Giá trị dN/dS lớn hơn 1 chứng tỏ có chọn lọc dương, tức là những đột biến không đồng nghĩa được ưu tiên trong quần thể. Trong khi tỉ số dN/dS=1 chứng tỏ có chọn lọc trung tính và dN/dS<1 chứng tỏ có chọn lọc âm, quần thể ưu tiên giữ lại trình tự protein gốc hơn là protein đột biến.
nhau được so sánh kiểm tra sự tương đồng sử dụng phần mềm Se_al
(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/seal/) , lưu ở định dạng PHYLIP, sau đó được đưa vào
phần mềm PHYML 3.0 [42] để dựng cây phát sinh loài, sử dụng mô hình biến đổi (substitution model) của Hasegawa-Kishino-Yano (HKY85), quá trình xây dựng cây được lặp lại 500 lần. Cây phát sinh loài sau đó được xem bằng phần mềm Fig tree
(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) và xuất ra ở định dạng JPEG.
Vẽ cây Minimum spanning tree bằng phần mềm Bionumeric 4.5
MSTREE là công cụ đồ họa cho phép liên kết các nút (node) với nhau trong một nhóm dữ liệu (dataset) sao cho tổng khoảng cách của các nhánh là nhỏ nhất. Thuật toán MST được cài đặt trong Bionumerics 4.5 được sử dụng để vẽ cây MSTREE từ số allele của tất cả các mẫu phân lập được. Thuật toán này sử dụng một kiểu di truyền (ST) có số lượng biến đổi ở một locus (single locus variants_SLVs) cao nhất làm nút gốc và dẫn xuất những ST khác từ đó. ST có từ 3 allele giống nhau trở lên được liên kết bằng đường gạch ngang.
2.3.5 Xác định các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng dạ dày ruột doSalmonella Salmonella
2.3.5.1Bảng câu hỏi khảo sát
Ngoài thông tin lâm sàng, chúng tôi còn thu thập các thông tin về thói quen ăn uống, vệ sinh và các đặc diểm kinh tế xã hội (tuổi, giới tính, thu nhập của gia đình, trình độ học vấn của cha mẹ); loại thức ăn cho bé (sữa mẹ, sữa bột,…); phương thức nuôi dạy trẻ (ở nhà hay đi nhà trẻ), nguồn thực phẩm (thức ăn mua ở chợ hay siêu thị), nguồn nước uống (nước máy, nước giếng, nước đóng chai) và các yếu tố tiếp xúc với
Dựa trên các thông tin thu thập được, chúng tôi sử dụng phần mềm Stata 11 (Statacorp, Mỹ) để tính toán các yếu tố dẫn đến nguy cơ nhiễm trùng Salmonella bằng cách so sánh nhóm bị bệnh tiêu chảy và nhóm khỏe mạnh. Chúng tôi sử dụng phương pháp hồi qui logistic để tính toán hệ số tương quan (odds ratio), OR thô và OR đã được hiệu chỉnh cho các đồng yếu tố.
Các chỉ số thống k ê :
Mối tương quan giữa việc nhiễm Salmonella và các thói quen ăn uống sinh hoạt được xác định bằng tỉ số nguy cơ. Trong đó việc người mắc bệnh và người khỏe mạnh có hay không có phơi nhiễm với một yếu tố nguy cơ (thói quen) nào đó được phân thành nhóm 1 và nhóm 2.
- Tỉ số nguy cơ (Odds ratio hay OR): là tỉ số của hai odd, thường được sử dụng trong các nghiên cứu bệnh-chứng.
Odd phản ảnh “khả năng” mắc bệnh. Odd được định nghĩa là tỉ số của hai xác suất. Nếu p là xác suất mắc bệnh, thì 1-p là xác suất sự kiện không mắc bệnh. Theo đó, odd được định nghĩa là:
odd p 1 p
OR dao động từ thấp hơn 1 đến lớn hơn 1. Nếu OR < 1, nguy cơ bị bệnh trong nhóm 1 thấp hơn trong nhóm 2 nghĩa là yếu tố nguy cơ đang quan tâm mang tính bảo vệ. Nếu OR > 1, nguy cơ bị bệnh trong nhóm 1 cao hơn nhóm 2 nghĩa là yếu tố nguy cơ đang quan tâm không mang tính bảo vệ và nếu OR = 1, không có mối liên hệ giữa yếu tố nguy cơ và bệnh.
KẾT QUẢ- BIỆN LUẬN
3.1 Tỉ lệ nhiễm trùng không triệu chứng ở trẻ em dưới 5 tuổi tại thành phố Hồ Chí Minh
Trong số 609 bệnh nhân thuộc nhóm chứng tham gia nghiên cứu, 37 trong số đó có mẫu phân dương tính với NTS, chiếm tỉ lệ 6.08%. Tỉ lệ này cao hơn nhiều tỉ lệ 1% và 2.7% trong hai nghiên cứu khác nhau trên trẻ em dưới 5 tuổi ở Hà Nội vào năm 2006 và 2007[7, 46]. Tỉ lệ này là tương đương với tỉ lệ chúng tôi quan sát được trong nghiên cứu thử nghiệm vaccine ngừa thương hàn M01ZH09 năm 2007 khi khoảng 7% trẻ tham gia nghiên cứu có mẫu phân dương tính với NTS trong vòng 1 đến 14 ngày sau khi uống[97]. Tỉ lệ này tương ứng với nghiên cứu trên trẻ em từ 2 đến 4 tuổi ở Yutacan, Mexico[79] cũng như nghiên cứu trên người nhà của bệnh nhân nhiễm trùng máu ở Kenya, Nam Phi[53]. Tuy nhiên tỉ lệ này thấp hơn rất nhiều trên những nghiên cứu mang trùng không triệu chứng ở trẻ em là con nuôi ở Pháp(47.5%)[8] và Thụy Điển (54%)[8, 92].
3.2 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng Salmonella spp phân lập từ nhóm người bệnh và nhóm người khỏe mạnh không triệu chứng bệnh và nhóm người khỏe mạnh không triệu chứng
Các chủng Salmonella phân lập từ nhóm bệnh có tỉ lệ kháng cao hơn các chủng phân lập từ nhóm mang trùng không triệu chứng, với khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0.05 ở các kháng sinh Ampicillin, Augmentin, Ceftazidime, Chloramphenicol, Gentamicin và Trimethoprim – sulfamethoxazole.
Ở nhóm chủng phân lập từ người bệnh, đa phần các chủng đều có tính kháng cao với các kháng sinh được sử dụng phổ biến trong cộng đồng như Ampicillin (64.94%), Chloramphenicol (45.45%) và Trimethoprim – sulfamethoxazole (41.56%). Tính kháng đối với các kháng sinh thuộc họ flouroquinolones như Ciprofloxacin và Oxfloxacin, hai loại kháng sinh được sử dụng chủ yếu trong điều trị tiêu chảy ở Việt Nam, vẫn còn ở mức thấp dao động từ 5.19% đến 6.49%. Điều đáng lưu ý là có đến
70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
7.79% tổng số chủng kháng với Ceftriaxone hoặc Ceftazidime, kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ 3.
Bi
ểu đồ 3.1: Tỉ lệ kháng kháng sinh của 174 chủng Salmonella
AMP AUG CAZ CHL CN CRO CIP NA OFX SXT Nhóm bệnh 64.94 16.88 7.79 45.45 22.08 7.79 5.19 28.57 6.49 41.56 Nhóm mang trùng không triệu
chứng 11.58 6.32 0.00 10.53 5.26 0 2.11 17.89 1.05 13.68
Nguyên nhân của tính kháng kháng sinh có thể do việc tự ý sử dụng kháng sinh để chữa bệnh góp phần làm tỉ lệ kháng kháng sinh tăng cao. Bởi vì việc chữa trị thường