Nguyên tắc
API 20E là hệ thống định danh sinh hóa cho các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Hệ thống này là một dải plastic với 20 ống nhỏ chứa hóa chất khử nước của ornithine, citrate, H2S, ure, tryptophan, indole, voges-proskauer, gelatin
Hình 2.1: Kết quả que thử API 20E cho Salmonella spp
Các thử nghiệm bao gồm: ONPG (b-galactosidase), ADH (khử CO2 của arginine bằng arginine dihydrolase), LDC (khử CO2 của lysine bằng lysine decarboxylase), ODC (khử CO2 của ornithine bằng ornithine decarboxylase), CIT (sử dụng citrat như nguồn C duy nhất), H2S (hydrogen sulfide), URE (urease), TDA (tryptophan deaminase), IND: (tryptophanase, Indole phát hiện bằng thuốc thử Kovac), VP (thử nghiệm Voges-Proskauer), GEL (gelatinase ), GLU (lên men glucose), MAN (mannose), INO (inositol), SOR (lên men sorbitol), RHA (lên men rhamnose), SAC (lên men sucrose), MEL (lên men melibiose), AMY (lên men amygdalin), ARA (lên men arabinose) và OX (cytochrome oxidase).
Bằng thử nghiệm API20E này Salmonella spp được phát hiện khi cho phản ứng LDC, ODC và H2S dương tính. Sử dụng được glucose (GLU), manitol (MAN), sorbitol (SOR), rhamnose (RHA), melibiose (MEL), arabinose (ARA) và có oxidase âm tính.
Hóa chất và dụng cụ
● Môi trường MC (Mac Conkey) gồm pepton (17g/l), Proteose Peptone (3g/l), Lactose (10g/l), Bile Salts No.3 (1.5g/l), NaCl (5g/l), Agar (13.5g/l), Neutral Red (0.03g/l) và tím tinh thể (0.001g/l).
● Môi trường XLD (xylose-lysine-deoxychocolate agar) gồm cao nấm men (3g), L-lysine (5g), Xylose (3.75g), Lactose (7.5g), Sucrose (7.5g), Natri
(9.5g), NaH2PO4 (10g) và Sodium selenite (0.004g) trong 1 lít.
● Môi trường NA (Nutrition agar) gồm pepton (5g/l), cao thịt (2g/l), NaCl (1g/l), Agar (20g/l).
● Bộ kit API 20E.
● Nước muối sinh lý.
● Phiến kính, que cấy, đèn bun-sen.
Tiến hành
Mẫu phân được lấy trực tiếp từ bệnh nhân, giữ trong lọ vô trùng. Dùng que cấy cấy mẫu bệnh phẩm lên môi trường chọn lọc MC, XLD, và cho khoảng 2g phân tươi vào môi trường tăng sinh SB. Ủ vi khuẩn ở 37oC trong 18 đến 24 giờ. Chọn các khuẩn lạc trong không màu (do không lên men đường lactose) trên môi trường MC hoặc khuẩn lạc đỏ chấm đen trên môi trường XLD để tiến hành định danh bằng kit API 20E. Song song đó, các khuẩn lạc này cũng được cấy trên môi trường NA để kiểm tra độ thuần. Bênh cạnh đó, bệnh phẩm sau khi tăng sinh trong môi trường Selenite Broth cũng được cấy trên môi trường MC và XLD để tìm Salmonella spp.
Tạo huyền phù khuẩn lạc thuần trong 5ml dung dịch nước muối sao cho mật độ vi khuẩn ở vào khoảng 0,5 McFarland, nhỏ vào các ống trong dải API 20E. Riêng các ống chứa arginine, lysine, ornithine, H2S và ure được phủ thêm một lớp dầu khoáng nhằm tạo điều kiện kị khí. Dải plastic được đem ủ ở 37oC và đọc kết quả sau 24 giờ. 21 phản ứng sinh hóa, bao gồm phản ứng phát hiện oxidase, được chuyển đổi thành hệ thống gồm 7 số theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhập kết quả này vào cơ sở dữ liệu để định danh vi khuẩn.
để xác định nhóm huyết thanh B, C và D.
Nguyên tắc
PSO là kháng huyết thanh được sử dụng để phát hiện các nhóm vi khuẩn có mang kháng nguyên O thuộc giống Salmonella từ nhóm A đến nhóm G. O4 là kháng nguyên đặc hiệu cho nhóm huyết thanh B. O6, O7 dùng để xác định nhóm huyết thanh C và O9
đặc hiệu cho kháng nguyên O của nhóm huyết thanh D. Nguyên tắc của phản ứng này dựa vào sự tạo thành các lực nối tĩnh điện hoặc các nối đồng hóa trị giữa các kháng thể đã biết và kháng nguyên trên bề mặt tế bào vi khuẩn.
Hóa chất và dụng cụ
● Bộ hóa chất kháng huyết thanh gồm 4 lọ: PSO, O4, O6, O7 (Murex, Anh).
● Nước muối sinh lý.
● Phiến kính, que cấy, đèn bun-sen.
Tiến hành
Hoà tan một khóm trùng trong một giọt nước muối sinh lý trên phiến kính sạch và kiểm tra loại trừ phản ứng tự ngưng kết. Nhỏ 1µl kháng huyết thanh vào và dùng que cấy hoà đều, sau đó quan sát kết quả sau một phút. Phản ứng ngưng kết dương tính khi có sự tạo thành các hạt tủa, phản ứng âm tính khi dung dịch đồng nhất không xuất hiện các hạt tủa. Các thí nghiệm ngưng kết đều được thực hiện đồng thời với một huyền phù vi khuẩn để dùng làm đối chứng âm.
sinh chứa những hàm lượng đã biết được đặt lên bề mặt của một đĩa agar (ở đây sử dụng môi trường Muller-Hinton) chứa môi trường không chọn lọc đã được trải vi khuẩn cần xác định. Kháng sinh sẽ khuếch tán ra môi trường tạo nên vòng ức chế sự phát triển của vi khuẩn xung quanh đĩa. Các vòng vô khuẩn này được đo đường kính và so sánh với tiêu chuẩn cho phép nhằm xác định mức độ nhạy của chủng vi khuẩn đối với kháng sinh sử dụng (nhạy, trung gian hoặc kháng).
Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm kháng sinh phải là môi trường không chứa các yếu tố ức chế hoạt động kháng sinh, có pH trung tính (7,2-7,4), nồng độ cation hoá trị II (Ca2+, Mg2+ ) không được quá cao vì những ion này có thể kết hợp với thuốc kháng sinh hoặc vi khuẩn làm sai lệch kết quả.
Hóa chất và dụng cụ
- Môi trường
Chúng tôi sử dụng môi trường thạch MH, độ dày của thạch phải đúng 4mm. Thành phần môi trường MH gồm cao thịt bò (300 g/l), casein hydrolysate (17,5 g/l), tinh bột (1.5g/l), agar (17,0 g/l), pH 7.4 ± 0.2.
- Kháng sinh
Các đĩa kháng sinh (Oxoid) được sử dụng : Ampicillin, Augumentin, Ceftazidime, Ceftriazone, Trimethoprim - sulfamethoxazole, Chloramphenicol, Nalidixic acid, Ofloxacin, Ciprofloxacin.
Tiến hành
Tạo huyền phù khuẩn lạc thuần trong 2 ml dung dịch nước cất sao cho mật độ vi khuẩn ở vào khoảng 0,5 McFarland. Sử dụng tăm bông trải đều dịch huyền phù vi khuẩn này lên bề mặt thạch MH theo ba chiều. Đặt đĩa kháng sinh lên đĩa môi trường MH đã được trải vi khuẩn, và ủ đĩa ở 37oC. Sau 12-16 giờ, đọc kết quả đường kính vòng vô khuẩn.
Kết quả nhạy, trung gian hoặc kháng với kháng sinh được đọc dựa theo tiêu chuẩn của Viện Các Tiêu Chuẩn Trong Phòng Thí Nghiệm và Lâm Sàng (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI) (bảng 2.1).
Bảng 2.1 : Tiêu chuẩn về tính kháng đối với một số kháng sinh của họ vi khuẩn
Enterobacteriaceae
Tên kháng sinh Lượng kháng sinh trên 1 đĩa Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Giá trị MIC (µg/ml)
Kháng Trung gian Nhạy Kháng Nhạy
Ampicillin 10 µg ≤ 13 14 - 16 ≥ 17 ≥ 32 ≤ 8
Trimethoprim-
sulfamethoxazole 23,75 µg ≤ 10 11 - 15 ≥ 16 ≥ 8/152 ≤ 2 / 38
Chloramphenicol 30 µg ≤ 12 13 - 17 ≥ 18 ≥ 32 ≤ 8
Ofloxacin 5 µg ≤ 12 13 - 15 ≥ 16 ≥ 8 ≤ 2
Ciprofloxacin 5 µg ≤ 15 16 - 20 ≥ 21 ≥ 4 ≤ 1
Gatifloxacin 5 µg ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 ≥ 8 ≤ 2
Ceftriazone 30 µg ≤ 13 14 - 20 ≥ 21 ≥ 64 ≤ 8
Ceftazidime 30 µg ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 ≥ 32 ≤ 8
2.3.4 Xác định sự đa dạng di truyền bằng phương pháp MLST2.3.4.1Tách chiết DNA vi khuẩn 2.3.4.1Tách chiết DNA vi khuẩn
Chuyển một khuẩn lạc đơn Salmonella spp. vào 5 ml môi trường LB, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC với tốc độ lắc 150 vòng/phút. Dịch nuôi cấy sau đó được ly tâm ở 13200 vòng/phút trong 1 phút để thu sinh khối. DNA bộ gen của vi khuẩn được tách chiết bằng bộ kít Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Mỹ). DNA sau khi thu nhận được xác định nồng độ bằng máy đo quang phổ kế Nanodrop (Eppendorf, Đức).
Nguyên tắc tách chiết DNA bằng Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Mỹ):
Ly giải tế bào để phóng thích DNA. Ủ với RNase để loại bỏ RNA trong mẫu. Biến tính protein.
● Máy li tâm (Eppendorf, Đức).
● Tube 1.5ml.
● Bộ kít tách chiết DNA của Promega (gồm dung dịch ly giải tế bào, dung dịch RNase, dung dịch tủa protein, isopropanol và ethanol 70%, dung dịch hòa tan DNA).
Tiến hành:
● Ly giải tế bào: sau khi ly tâm dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm, sinh khối vi khuẩn được thu nhận và được hòa tan trong 600 µl dung dịch phá màng (nuclei lysis) và ủ ở 80oC trong 5 phút. Hỗn hợp sau đó được để ở nhiệt độ phòng và thêm 3 µl RNAse vào, trộn đều, và ủ ở 37oC trong 45 phút.
● Loại bỏ protein: 200 µl dung dịch tủa protein (protein precipitation) được thêm vào hỗn hợp, trộn kỹ, và ủ trên đá lạnh trong 15 phút, sau đó ly tâm ở 13200 vòng/phút trong 15 phút.
● Tủa và tinh sạch DNA: phần dịch nổi trong ống được chuyển sang một eppendorf mới có chứa 600 µl isopropanol ở nhiệt độ phòng, đảo đều nhẹ, và ly tâm ở 13200 vòng/phút trong 2 phút. Sau đó dịch nổi được loại bỏ nhằm thu kết tủa. 600 µl ethanol 70% ở nhiệt độ phòng được thêm vào, ly tâm ở 13200 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ ethanol và làm khô bằng máy quay chân không trong 10 – 15 phút.
● Dung giải DNA trong 100 µl dung dịch rehydration (đi kèm với bộ kít), ủ ở 65oC trong 60 phút và sau đó được bảo quản ở 4oC.
B
ảng 2.2: Trình tự các mồi sử dụng cho phản ứng PCR
Gen Trình tự Kích thước
aroC Mồi xuôi 5'-CCTGGCACCTCGCGCTATAC-3'
Mồi ngược 5'-CCACACACGGATCGTGGCG-3'
dnaN Mồi xuôi 5'-ATGAAATTTACCGTTGAACGTGA-3'
Mồi ngược 5'-AATTTCTCATTCGAGAGGATTGC-3'
hemDMồi xuôi 5'-ATGAGTATTCTGATCACCCG-3'
Mồi ngược 5'-GACCAATAGCCGACAGCGTAG-3'
hisD Mồi xuôi 5'-GTCGGTCTGTATATTCCCGG-3'
Mồi ngược 5'-GGTAATCGCATCCACCAAATC-3'
purE Mồi xuôi 5'-CGCATTATTCCGGCGCGTGT-3'
Mồi ngược 5'-CGCGGATCGGGATTTTCCAG-3'
sucA Mồi xuôi 5'-AGCACCGAAGAGAAACGCTG-3'
Mồi ngược 5'-GGTTGTTGATAACGATACGTAC-3'
thrA Mồi xuôi 5'-ATCCCGGCCGATCACATGAT-3'
Dung dịch đệm 10X 5 µl 1X dNTPs (20mM mỗi loại) 0.75 µl 0.3mM MgCl2 (50mM) 2 µl 2mM Mồi xuôi (10µM) 2 µl 0.4µM Mồi ngược (10µM) 2 µl 0.4µM DNA bản mẫu (50ng) 2µl 2ng/µl
Taq polymerase (5U/µl) 0.1 µl 0.5U
Nước cất vừa đủ 50µl
Bảng 2.4 : Chương trình phản ứng khuếch đại
Bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Biến tính 96oC 3 phút 1 chu kỳ
Biến tính 96 oC 15 giây
Bắt cặp 55 oC 15 giây
Kéo dài 72 oC 30 giây
Kéo dài 72 oC 5 phút 1 chu kỳ
2.3.3.3 Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose
Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Gel agarose có cấu tạo nền như tổ ong có thể phân tách các trình tự DNA
Hóa chất và dụng cụ:
● Dung dịch đệm Tris-borat/EDTA 10X (TBE): 108g Tris base, 55g acid boric, 40ml EDTA 0.5M.
● Dung dịnh đệm mang mẫu (6X) gồm 0,25% phẩm màu cam, 30% glycerol trong nước.
● 10mg/ml Ethidium bromide trong nước (2,7-diamino-10-ethyl-9- phenylphenanthridinium bromide).
● Thang DNA lamda 100 bp chuẩn (Invitrogen) với vạch thấp nhất là 100 bp, cao nhất là 2072 bp, từ vạch 100 bp đến vạch 1500 bp mỗi vạch cách nhau 100 bp (hình 2.1).
● Máy phát hiện DNA bằng tia UV (Vilber Lourmat) và hệ thống chụp hình, phân tích kết quả bằng hệ thống Gel Doc (Biorad, Mỹ). Các vạch được phân tích bằng phần mềm Quantity One (Biorad, Mỹ).
Tiến hành :
● Tạo bảng gel 2%: Cân 2g agarose hoà trong 100ml dung dịch đệm TBE, đun sôi cho agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội khoảng 50oC. Cho vào dung dịch 3µl Ethidium bromide, lắc đều và đổ gel vào khay có gắn lược tạo giếng. Gel sẽ định hình sau khoảng 30-60 phút.
● Điện di: 10µl sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được trộn với 2 µl dung dịch đệm mang mẫu có nồng độ 6X (loading buffer). Tất cả hỗn hợp được cho vào các giếng của bảng gel 2% và chạy điện di cùng với 6 µl thang DNA 100 bp (50ng/ml). Quá trình điện di được thực hiện trong 45 phút, ở điện thế 180
Volt.
● Kích thước sản phẩm DNA được phát hiện và kiểm tra bằng máy đo UV ở bước sóng 590nm trong vùng ánh sáng đỏ cam và kết quả được phân tích bằng phần mềm Quantity One.
2.3.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR
Nguyên tắc
Bộ kit QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) kết hợp ưu điểm của kỹ thuật ly tâm cột và đặc điểm bám có chọn lọc của DNA mạch đôi vào màng siclica. Những dung dịch đệm trong bộ kit được thiết kế để thu được DNA hiệu quả nhất và loại bỏ những tạp chất khác. Ở nồng độ muối cao, DNA sẽ bám vào màng silica trong khi những tạp chất khác như mồi, muối, enzyme… sẽ đi qua cột. Tạp chất được loại bỏ
● Máy ly tâm
● Eppendorf 1.5ml
● Bộ kit QIAquick bao gồm: Dung dịch rửa PE, dung dịch kết dính PBI (Guanidine hydrochloride, isopropanol), dung dịch EB (10mM Tris-Cl, pH 8.5).
Tiến hành
● Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick PCR Purification Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cho một thể tích sản phẩm PCR vào 5 thể tích của dung dịch PBI có sẵn trong eppendorf 1.5ml và trộn đều.
● Chuyển toàn bộ hỗn hợp này vào cột của bộ kit, ly tâm 13200 vòng/phút trong 1 phút. Đổ bỏ phần dịch chảy xuống ống, đặt cột trở lại vào ống.
● Thêm 0.75 ml dung dịch rửa PE vào cột, ly tâm 13200 vòng/phút trong 1 phút. Đổ bỏ phần dịch chảy xuống, đặt cột trở lại ống, ly tâm 13200 vòng/phút trong 1 phút nữa.
● Đặt cột vào một eppendorf sạch.
● Thêm 50 µl dung dịch EB vào trung tâm của màng và ly tâm 13200 vòng/phút trong vòng 1 phút. Thu phần dịch chảy xuống có chứa DNA.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đo nồng độ DNA và pha loãng với nước để có được nồng độ 40ng/µl dùng cho phản ứng giải trình tự.
Nguyên tắc giải trình tự do Sanger và cộng sự đưa ra vào năm 1977 dựa trên sự hình thành một tập hợp nhiều oligonucleotide có chiều dài khác nhau và mỗi oligonucleotide có xác suất xuất hiện bằng nhau trong phản ứng. Các trình tự này sau đó được tách ra dựa vào kích thước bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có khả năng phân tách hai trình tự chỉ khác nhau một nucleotide. Kết quả điện di được đọc bằng một máy dò tự động.
Hóa chất và dụng cụ
● Dung dịch đệm cho phản ứng PCR giải trình tự
● Dung dịch BigDye Terminator (chứa ddNTP, DNA polymerase)
● DNA mạch khuôn đã được tinh sạch và xác định nồng độ, lượng DNA mẫu phụ thuộc vào kích thước và cấu hình của DNA.
● Mồi sử dụng cho phản ứng như trình bày trong bảng 2.5
● Nước cất.
Bảng 2.5: Trình tự mồi cho phản ứng giải trình tự
Gen Trình tự mồi
aroC Mồi xuôi 5'-GGCACCAGTATTGGCCTGCT-3'
Mồi ngược 5'-CATATGCGCCACAATGTGTTG-3'
dnaN Mồi xuôi 5'-CCGATTCTCGGTAACCTGCT-3'
Mồi ngược 5'-CCATCCACCAGCTTCGAGGT-3'
hemD Mồi xuôi 5'-GTGGCCTGGAGTTTTCCACT-3'
Mồi ngược 5'-CGCGGATCGGGATTTTCCAG-3'
sucA Mồi xuôi 5'-AGCACCGAAGAGAAACGCTG-3'
Mồi ngược 5'-GGTTGTTGATAACGATACGTAC-3'
thrA Mồi xuôi 5'-ATCCCGGCCGATCACATGAT-3'
Mồi ngược 5'-CTCCAGCAGCCCCTCTTTCAG-3'
Tiến hành
Trong nghiên cứu này, chúng tôi giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động ABI 3310 (Applied Biosystem, Mỹ) sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit (Applied Biosystem, Mỹ) với các thành phần phản ứng và chương trình như bảng 2.6 và 2.7. Bảng 2.6 : Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự Thành phần Thể tích BigDye Terminator 1 µl Dung dịch đệm 3.5 µl Mồi (10 µM) 4 µl DNA khuôn (40ng/ µl) 1 µl Nước cất 10.5 µl Thể tích tổng cộng 20 µl
96oC 1 phút 1 chu kỳ
96oC 20 giây
55oC 20 giây
60oC 4 phút
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng cách tủa với Ethanol:
● Cho 4 µl dung dịch dừng phản ứng (gồm 2 µl NaOAc 1.5 M và 2 µl EDTA 50mM vào mỗi eppendorf.
● Chuyển toàn bộ sản phẩm PCR vào từng eppendorf và trộn đều.
● Thêm 60 µl ethanol 95% lạnh (-200C) vào trộn đều. Ly tâm ngay lập tức ở 13200 vòng/phút trong 15 phút ở 40C.
● Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, không chạm vào phần tủa.
● Rửa tủa DNA bằng 200 µl ethanol lạnh (-200C) 70% hai lần. Mỗi lần rửa ly tâm 13200 vòng/phút trong 2 phút ở 40C. Sau khi ly tâm, cẩn thận đổ bỏ dịch nổi.
● Sấy khô bằng máy hút chân không trong 10 phút.
● Huyền phù mẫu tủa trong 10 µl dung dịch nạp mẫu HiDi formamide (Applied Biosystem). Mẫu trước khi tiến hành giải trình tự được ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút để DNA tan hoàn toàn.
2.3.3.6 Phân tích kết quả giải trình tự
với mỗi locus). Sau đó chúng tôi nhập trình tự của mỗi allele của mỗi mẫu phân lập lên trang web MLST của Salmonella spp (http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Senterica ). Kết quả chúng tôi thu nhận về là dữ liệu về số của 7 allele tại 7 loci của mỗi mẫu phân lập.
Sau khi có dữ liệu về các allele, tiếp tục nhập dữ liệu này lên mục tìm kiểu trình tự ST (sequence type) của trang web MLST để thu được số của kiểu trình tự của mỗi mẫu phân lập, từ đó xác định týp huyết thanh dựa trên dữ liệu của chủng đi kèm kiểu trình tự đó.
2.3.3.7 Phân tích kết quả MLST