1.4.1. Tình hình nhiễm NTS trên thế giới
Ước tính hàng năm có khoảng 93.8 triệu ca nhiễm trùng dạ dày ruột do
Salmonella trên toàn thế giới, với tỉ lệ tử vong là 155.000 ca. Trong đó khoảng 80.3
triệu ca là do ngộ độc thực phẩm [71]. Riêng tại Mỹ, ước tính hàng năm có khoảng 1.4 triệu ca ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Salmonella[72, 101].
Hai týp huyết thanh gây bệnh ở người phổ biến nhất ở cả 6 châu lục là S. Enteritidis và S. Typhimurium[30]. S. Enteritidis là týp huyết thanh phổ biến toàn cầu, đặc biệt là ở Châu Âu (chiếm 80% số ca bệnh) và Châu Á (38% số ca). Đại dịch S. Enteritidis được ghi nhận lần đầu vào cuối thập niên 80 và có nguồn gốc từ trứng gia
cầm bị nhiễm khuẩn[40]. Trứng gia cầm thường được sử dụng trong thực phẩm không cần qua quá trình gia nhiệt, chẳng hạn như bột làm bánh, kem làm tại nhà, sốt mayonaise và được phân phối rộng khắp. Vì vậy những thực phẩm nhiễm bẩn này có tác động đáng kể đến vấn đề y tế công cộng.
S. enterica týp huyết thanh Typhimurium (Typhimurium) là một trong những
nguyên nhân hàng đầu gây bệnh nhiễm trùng thực phẩm và được chú trọng trong hệ thống khảo sát của các quốc gia trên toàn thế giới. Công thức kháng nguyên cho týp huyết thanh này là 1,4,[5],12 :i :1,2 nhưng có nhiều subtype đã được mô tả, phần lớn bởi phage typing và ít phổ biến hơn là bằng MLST[93]. Những subtype này thường được gọi là biến thể (variant) hoặc pathovariant của Typhimurium vì chúng khác biệt cả về mặt kí chủ và mức độ thích nghi với kí chủ. Ở các nước phát triển, Typhimurium là một trong những týp huyết thanh phổ biến gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột. Tuy nhiên ở các nước kém phát triển thuộc khu vực sa mạc Sahara của Châu Phi, Typhimurium ST 313 thường gây bệnh nhiễm trùng hệ thống trên người[58]. Typhimurium ST19 là biến thể gốc của Typhimurium, đã được ghi nhận trong cơ sở dữ liệu MLST phân lập từ gia súc, heo, người, gia cầm và ngựa.
Nhiễm Typhimurium cũng qua đường ăn uống giống như Typhi, mặc dù bệnh cảnh thường thấy là nhiễm trùng dạ dày ruột hơn là nhiễm trùng hệ thống. Typhimurium cũng xâm nhập tế bào biểu mô ruột, nhưng có liên quan đến sự tiết IL-8 ở tế bào chủ và thu hút bạch cầu trung tính neutrophil đến nơi nhiễm trùng, gây phản ứng viêm tại chỗ. Vi khuẩn không phát tán khắp cơ thể, triệu chứng tiêu chảy gây ra bởi nhiễm trùng thường tự khỏi trong vòng vài ngày.
Sự phân bố của các týp huyết thanh ở động vật, thực phẩm, thức ăn gia súc và môi trường đa dạng hơn so với các týp huyết thanh phân lập từ người[81]. Sự khác nhau này có thể được giải thích do sự khác biệt về khả năng gây bệnh của các týp huyết thanh khác nhau. Sự phân bố các týp huyết thanh này khác nhau ở từng châu lục
(hình 1.3 và 1.4) phản ánh sự khác biệt về vị trí địa lý, tập quán chăn nuôi hoặc sự hạn chế về khả năng phân lập và định danh của các phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới dẫn đến việc báo cáo ít đi các týp huyết thanh.
Hình 1.3: Tỉ lệ các týp huyết thanh phổ biến nhất ở người phân lập từ các châu lục khác nhau[30].
Hình 1.4: Tỉ lệ các týp huyết thanh phổ biến nhất ở các nguồn không từ người phân lập ở các châu lục khác nhau[30].
Mặc dù có hơn 1500 týp huyết thanh thuộc S.enterica phân loài enterica đã được biết (hình 1.1), độc lực của hầu hết các týp huyết thanh đó chưa được xác định. Chỉ một số ít týp huyết thanh Salmonella gây bệnh trên người và động vật, và khác nhau bởi vật chủ và triệu chứng chúng gây ra[50]. Một số týp huyết thanh gây bệnh tiêu chảy trên phổ rộng các loài vật chủ khác nhau, ví dụ như Typhimurium và Enteritidis chịu trách nhiệm cho từ 40-90% số ca nhiễm trùng tiêu hóa do Salmonella trên người ở nhiều nơi trên thế giới, cũng như phần lớn các bệnh nhiễm trùng trên động vật nuôi. Một số týp huyết thanh gây bệnh tùy theo vật chủ, thường liên quan đến nhiễm trùng hệ thống trên một số ít vật chủ nhưng đồng thời cũng có liên quan đến một số bệnh hiếm gặp trên những động vật khác. Ví dụ như týp huyết thanh Dublin và Choleraesuis nhìn chung thường gây bệnh nhiễm trùng hệ thống trên gia súc và heo, nhưng đồng thời cũng gây bệnh trên người và một số động vật khác[77]. Tương tự là Typhimurium, một týp huyết thanh gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột rất phổ biến ở người, cũng gây bệnh nhiễm trùng hệ thống trên chuột. Typ Gallinarum chủ yếu gây bệnh trên gà[95]. Cuối cùng là một số týp huyết thanh thuộc loại chỉ gây bệnh trên một số vật chủ nhất định, gây bệnh nhiễm trùng hệ thống trên một số loài có quan hệ rất gần nhau. Ví dụ như týp huyết thanh Typhi và Paratyphi A chỉ gây bệnh trên người và những động vật linh trưởng bậc cao khác, bệnh cảnh là nhiễm trùng hệ thống dưới dạng sốt thương hàn. Thỉnh thoảng, những týp huyết thanh có phổ gây bệnh rộng hoặc những týp huyết thanh thích nghi trên vật chủ không phải là người cũng có thể gây bệnh nhiễm trùng xâm lấn trên người (với tên gọi là nhiễm trùng xâm lấn do NTS)[50,
60]. Điều này được cho là tùy thuộc vào độc lực của vi khuẩn, sự khiếm khuyết về miễn dịch của cá thể người, hoặc là sự kết hợp của cả 2 yếu tố đó[25, 26] và có thể khác nhau tùy vào vị trí địa lý[60]. Ví dụ như Typhimurium và Enteritidis có liên quan mật thiết với số ca nhiễm trùng hệ thống do NTS ở trẻ em và người lớn nhiễm HIV ở nhiều nơi thuộc Châu Phi[39, 48, 58], trong khi Choleraesuis lại là týp huyết thanh chính gây bệnh này ở Đài Loan[14].
1.4.2. Tình hình nhiễm NTS ở Việt Nam
Một số ít các nghiên cứu dịch tễ về những tác nhân gây tiêu chảy ở Hà Nội trên bệnh nhi nhỏ hơn 5 tuổi cho thấy bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột do NTS đang tăng nhanh từ 0% năm 2004[76] lên 3.6% năm 2007[46] và 7% năm 2008[45]. Các dữ liệu này cho thấy NTS đang là một trong những tác nhân vi khuẩn chính gây tiêu chảy ở miền Bắc.
Các nghiên cứu trên động vật cho thấy tỉ lệ nhiễm Salmonella spp trên thịt (heo, bò, gà) và hải sản (tôm) ở Đồng bằng Sông Cửu Long là khá cao, dao động từ 21% đến 69.9%[82]. Các týp huyết thanh phân lập được cũng khá đa dạng. Nghiên cứu của Tran TP và cộng sự (2004) cũng cho kết quả tương tự, cho thấy các týp huyết thanh khác nhau của Salmonella spp được phân bố rộng khắp trên động vật nuôi ở miền Nam[98] cũng như miền Bắc[65].
1.5. Các phương pháp phân loại di truyền Salmonella enterica
1.5.1. Phage typing
Phage typing là phương pháp truyền thống dùng để phân biệt Typhi dựa trên khả năng ly giải vi khuẩn có kháng nguyên Vi của Vi-phage. Sau đó, phương pháp này được nhanh chóng áp dụng trên Typhimurium, sử dụng 29 loại phage để phân biệt 34 týp khác nhau[109]. Hiện nay phage typing chỉ được sử dụng để phân biệt những týp huyết thanh quan trọng của Enteritidis và Typhimurium như PT4 và DT104. Phương pháp này rất hữu ích trong việc xác định các chủng Salmonella phân lập ở những nơi khác nhau vào các thời điểm khác nhau là giống hay khác tùy vào phản ứng nhạy kháng với một hỗn hợp các phage dùng để phân loại.
Phage typing có thể phân biệt các chủng có mối quan hệ gần gũi nhưng khả năng phân biệt bị hạn chế bởi số loại phage hiện có cũng như một số chủng không thể định type bằng kĩ thuật này. Phage typing đòi hỏi việc duy trì nhiều loại bacteriophage chỉ có thể hiện diện trong các phòng thí nghiệm chuẩn. Hơn nữa, việc diễn giải kết quả
đòi hỏi kinh nghiệm nhất định. Một trong những yếu tố quan trọng của phương pháp phage typing là tính ổn định dài hạn của hỗn hợp phage.
1.5.2. Plasmid typing
Plasmid typing là phương pháp phân biệt dựa trên sự khác biệt về kiểu hình cắt giới hạn của plasmid. Các chủng vi khuẩn được phân biệt dựa trên sự hiện diện, số lượng và kích thước các phân đoạn plasmid có trong vi khuẩn sau khi được xử lý bằng enzyme cắt giới hạn và điện di trên gel agarose. Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này không phải chủng Salmonella nào cũng có mang plasmid vì vậy những chủng không mang plasmid sẽ không được phân biệt bằng phương pháp này[27]. Hơn nữa plasmid là chỉ thị di truyền không ổn định, có thể được thu nhận và mất đi, vì vậy plasmid typing không thích hợp cho các nghiên cứu về tiến hóa.
1.5.3. Ribotyping
Trong phương pháp ribotyping, DNA bộ gen được cắt bằng enzyme cắt giới hạn, phân tách bằng điện di trên gel agarose và lai với mẫu dò DNA cho gen rRNA. Mặc dù gen rRNA có tính bảo tồn cao, chúng lại được bao hai đầu bằng những vùng có kích thước khác nhau cho phép phân biệt những chủng khác nhau. Phương pháp này có độ lặp lại cao và có thể được thực hiện tự động. Ngoài ra, có thể áp dụng nhiều enzyme cắt giới hạn cùng lúc để tăng khả năng phân biệt của phương pháp. Tuy nhiên phương pháp này có mặt hạn chế trong khả năng phân biệt một số týp huyết thanh do số lượng hạn chế các gen rRNA ở một số týp huyết thanh[27].
1.5.4. PFGE
PFGE được phát triển để phân loại các mảnh DNA kích thước từ 30-2000Kb trên gel agarose để phân loại phân tử nấm Saccharomyces cerevisiae. Trong PFGE, tế bào vi khuẩn được ly giải và DNA bộ gen được cắt bằng enzyme cắt giới hạn trong các plug agar để ngăn ngừa sự đứt gãy bộ gen và những mảnh DNA được phân tách bằng
điện di trong trường xung. Phương pháp này được sử dụng để phân tích những mẫu S. Typhi rời rạc hoặc những mẫu trong trận dịch. PFGE từ đó được sử dụng rộng rãi để phát hiện và nghiên cứu các vụ nhiễm Salmonella. Nhờ vào khả năng phân loại cao so với các phương pháp truyền thống như phage typing và nhiều phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn khác, PFGE trở thành tiêu chuẩn vàng cho những nghiên cứu về dịch tễ Salmonella từ năm 2001. Dữ liệu phân tử của những PFGE profile của nhiều týp huyết thanh Salmonella khác nhau được lưu trữ bởi CDC, cho phép nhiều nhà khoa học và nhà dịch tễ học thuộc mạng lưới PFGE (PulseNet) tham khảo[110].
PFGE là phương pháp tốn nhiều công sức và thời gian cũng như cần nhiều kĩ năng để hoàn thành qui trình và diễn giải kết quả. Một số chủng có thể được xem như tương đồng khi chỉ sử dụng một enzyme cắt giới hạn, vì vậy nhiều lần chạy PFGE khác nhau với nhiều enzyme cắt giới hạn khác nhau là cần thiết để kết quả có độ phân giải cao hơn.
1.5.5. MLEE
Multi locus enzyme electrophoresis (MLEE) dùng để phân loại các chủng dựa trên khả năng di động trên gel của nhiều enzyme nội bào khác nhau. Đột biến trên những gen mã hóa cho các enzyme này sẽ dẫn đến sự thay đổi các acid amin trong cấu trúc enzyme, từ đó ảnh hưởng đến cấu hình tích điện của các enzyme và vì vậy làm thay đổi tính di động trong điện trường của chúng. Tuy nhiên, phương pháp phân loại dựa trên điện di này lại khá chủ quan trong việc diễn dịch kết quả và khó chuẩn hóa giữa các phòng thí nghiệm.
1.5.6. MLST
Multi locus sequence typing (MLST) là phương pháp được phát triển vào năm 1998 để áp dụng nguyên lý của MLEE trên trình tự DNA, ví dụ như sự phát hiện những đột biến được tích lũy chậm chạp trên các loci có chọn lọc trung tính. Những allele này được phân lập trực tiếp từ trình tự nucleotide dài từ 400 đến 600 bp của
những gen giữ nhà thay vì so sánh khả năng di động của các enzyme chuyển hóa. Trong phương pháp MLST, những gen giữ nhà được chọn nằm rải rác trên bộ gen của vi khuẩn. Một đoạn DNA có kích thước xác định của mỗi gen giữ nhà được khuếch đại và giải trình tự. Một trình tự độc nhất được gán cho 1 số allele riêng biệt và tập hợp nhiều allele khác nhau cho một kiểu di truyền (sequence type) riêng biệt. Nhiều hạn chế của phương pháp MLEE đã được giải quyết nhờ phương pháp MLST. Kết quả có độ lặp lại và dữ liệu được lưu trữ ở dạng số trên website cho phép việc trao đổi thông tin được dễ dàng giữa các phòng thí nghiệm. MLST còn có thể được thực hiện tự động với số lượng mẫu lớn. Những allele được phân lập bằng MLST đến nay nhiều hơn MLEE vì chỉ có 5% sự thay đổi về mặt di truyền làm thay đổi tính chất di động của các enzyme chuyển hóa. Giá thành giải trình tự ngày càng giảm cũng là yếu tố hỗ trợ cho kĩ thuật này. MLST đã được sử dụng để nghiên cứu về mặt tiến hóa và mối quan hệ di truyền của nhiều sinh vật gây bệnh và không gây bệnh[70]. Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi và hiện có đến 48 hệ thống MLST cho nhiều sinh vật khác nhau
(http://web.mpiib-berlin.mpg.de/mlst/ , http://pubmlst.org/ và http://www.mlst.net/ ).
Hiện có 3 hệ thống MLST đã được phát triển để nghiên cứu mối liên hệ về mặt tiến hóa giữa những chủng Salmonella spp. Hệ thống MLST phân loại Salmonella do Kotetishvili và cộng sự đưa ra vào năm 2002 dựa trên bốn gen: 16S RNA, phosphomannomutase (manB), glutamine synthetase (glnA) và 1,2-propanediol utilization factor (pduF)[59]. Hệ thống này được phát triển để nghiên cứu dịch tễ của những trận dịch do Salmonella gây ra và được cho là phân biệt tốt hơn PFGE. Tuy nhiên việc chỉ sử dụng 4 gen có thể hạn chế việc ứng dụng kỹ thuật này trên một số lượng lớn mẫu. Sau khi nghiên cứu 12 loci trên Meningococcus, 7 loci được chọn để có độ phân giải vừa đủ và kết luận đáng tin cậy[70]. Hầu hết các hệ thống MLST hiện nay đều phải dựa trên từ 6 đến 10 loci.
Hệ thống MLST khác do Sukhnannand và cộng sự phát triển năm 2005[91] gồm việc giải trình tự của 5 gen giữ nhà là panB (ketopentoate hydroxymethyltransferase),
icd (isocitrate dehydrogenase), manB (phosphomannomutase), mdh (malate
dehydrogenase), aceK (isocitrate dehydrogenase kinase/phsophatase) và 2 gen mã hóa tính độc là gen fimA (fimbrial gene A) và spaN (surface presentation of antigens N). Những kiểu di truyền đặc hiệu cho týp huyết thanh được quan sát thấy ở các chủng
enterica dưới loài khác nhau. Tuy nhiên hệ thống này lại có những hạn chế trong việc
nghiên cứu tiến hóa ở vi khuẩn Salmonella vì nó bao gồm 2 gen mã hóa cho tính độc và 2 gen này có thể chịu ảnh hưởng của chọn lọc tự nhiên.
Hệ thống MLST do Kidgell và cộng sự phát triển năm 2002[56] dựa trên 7 gen giữ nhà nằm rải rác trên bộ gen của Salmonella Typhi CT18, 7 gen này mã hóa cho những enzyme chuyển hóa vì vậy không nằm dưới áp lực chọn lọc. Hệ thống 7 gen này gồm aroC (chorismate synthase), dnaN (DNA polymerase III beta subunit), hemD (uroporphyrinogen III cosynthase), hisD (histidinol dehydrogenase), purE (phosporibosylaminoimidazole carboxylase), sucA (α-ketoglutarate dehydrogense) và
thrA (aspartokinase and homoserine dehydrogenase). Hệ thống này phù hợp với yêu cầu
của một hệ thống MLST cơ bản vì vậy được áp dụng để phân loại tất cả các chủng
Salmonella. Cây phân loại di truyền được xây dựng dựa trên trình tự 7 gen giữ nhà của
nhiều chủng Salmonella cho thấy khoảng cách tiến hóa giữa các phân loài S. enterica và S.bongori (hình 1.5).
Hình 1.5: Kết quả cây phân loại di truyền cho Salmonella enterica[28]
Cây phân loại di truyền được dựa trên trình tự của 7 gen giữ nhà. Vòng tròn màu xanh là S. enterica thuộc phân loài 1. Vòng màu vàng bao gồm S. enterica thuộc các phân loài II, IIIa, IIIb, IV và VI. Vòng màu đỏ là S. bongori hay còn gọi là phân loài V.
1.6. Tình trạng mang vi khuẩn không triệu chứng ở S. Typhi và NTS
Người mang trùng mãn tính đầu tiên được phát hiện là Typhoid Mary, một đầu bếp người Mỹ và người này đã lây bệnh cho hàng trăm người. Mang trùng không triệu chứng được mô tả bằng việc thải một lượng lớn S. Typhi trong phân gây nhiễm bẩn thức ăn hoặc những vật dụng dùng chung khác, dẫn tới việc gây bệnh cho các cá thể khác trong cộng đồng. Tình trạng mang trùng không triệu chứng được cho là hệ thống giúp một vi sinh vật gây bệnh tồn tại một thời gian nhất định khi số lượng người nhạy cảm với bệnh không đủ lớn để duy trì vi sinh vật gây bệnh trong quần thể. Đây là đặc