a. Đặc điểm hình thái [8]
Khuẩn lạc các chủng vi khuẩn được nuơi cấy trên mơi trường TSA sau 48 giờ được quan sát dưới kính lúp để ghi nhận hình dạng, kích thước và màu sắc khuẩn lạc.
Quan sát các tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi: sau khi tăng sinh vi khuẩn trên mơi trường TSB, lấy mẫu, và quan sát trạng thái sống ở phiến kính lõm nhằm ghi nhận khả năng di động của chủng vi khuẩn. Ngồi ra, khả năng di động của chủng vi khuẩn cịn được quan sát trên mơi trường thạch mềm. Nếu ống mơi trường cĩ vi khuẩn mọc theo đường cấy và mọc lan ra bên ngồi đường cấy, làm nhịe ranh giới giữa đường cấy và ngồi đường cấy thì chủng vi khuẩn cĩ khả năng di động. Nếu vi khuẩn mọc theo đường cấy khơng lan ra bên ngồi thì vi khuẩn bất động.
b. Xác định Gram [4], [8]
Dùng phương pháp “String test” và nhuộm Gram nhằm xác định nhĩm gram, hình dạng và kích thước tế bào của các chủng vi khuẩn sau 2 ngày nuơi cấy.
+ Phản ứng “String test” với KOH 3%: Dàn đều vi khuẩn trong một giọt KOH 3% trên phiến kính, phản ứng kéo dài trong 60 giây, nếu cĩ hiện tượng kéo sợi thì đĩ là trắc nghiệm dương và vi khuẩn Gram âm do màng tế bào vi khuẩn bị
phá vỡ. Ngược lại, khơng thấy cĩ hiện tượng kéo sợi thì đĩ là trắc nghiệm âm và vi khuẩn Gram dương do KOH khơng tác động lên màng tế bào vi khuẩn.
+ Nhuộm Gram: Cho vi khuẩn vào giọt xanh methylen trên lame, cố định tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm bằng dung dịch tím tinh thể
(crystal violet) trong 1 phút, rửa nước. Nhuộm tiếp bằng dung dịch iod (lugol) trong 1 phút, rửa nước. Phủ lên mẫu dung dịch etanol 95%: aceton (1:1) trong 30 giây, rửa nước. Nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm safranin hay fuchsin ziehl trong (30 – 60) giây, rửa nước. Để khơ, quan sát dưới kính hiển vi xem sự bắt màu của vi khuẩn. Nhĩm vi khuẩn Gr(+)bắt màu tím nhờ khả năng giữđược phức chất tạo thành giữa tím tinh thể và iod; nhĩm vi khuẩn Gr(–) bắt màu với thuốc nhuộm bổ sung (đỏ
vàng Safranin hay đỏ tía Fuchsin).
c. Đặc điểm sinh lý [4], [8]
Các đặc điểm sinh lý được thực hiện bao gồm: – Quan hệ với oxi
– Ảnh hưởng của nhiệt độ
– Ảnh hưởng của pH
– Xác định đường cong tăng trưởng.
d. Đặc điểm sinh hố
Đồng hĩa các nguồn carbon [9], [10]
Nguyên tắc: Kiểm tra đặc tính đồng hĩa các nguồn carbon là kiểm tra khả
năng phát triển của vi sinh vật trên mơi trường chỉ chứa một nguồn carbon như là nguồn năng lượng duy nhất. Thử nghiệm này cĩ thể thực hiện trên mơi trường rắn hay lỏng. Tuy nhiên, mơi trường lỏng thường được sử dụng nhiều hơn.
Các nguồn carbon được dùng để đồng hĩa: Arabinose, cellobiose, dulcitol, glucose, maltose, lactose, galactose, sucrose, raffinose, xylose, mannitol, inositol, mannose, rhamnose, fructose, sorbitol, trehalose, glycerol.
Tiến hành: Hút vào ống nghiệm nhỏ 4,5 mL nước cất rồi đem hấp khử trùng ở
1210C trong 15 phút, bổ sung 0,5 mL dịch lọc các nguồn carbon đã lọc vơ trùng trong điều kiện vơ trùng để được nồng độ cuối là 1%.
Tiến hành cấy chủng vào các ống mơi trường bằng que cấy vịng sau đĩ ủ
các ống mơi trường ở 37 0C trong 3 tuần
Kết quả
– Mức độ phát triển của chủng được ước định bằng mắt, thực hiện như sau: trước tiên cần vortex để trộn đều tế bào, sau đĩ so sánh với cây thước cĩ
đường kẻ 0,75 mm.
– +: nếu dịng kẽ bị che khuất hồn tồn – w: nếu dịng kẻ thấy mờ
– –: nếu dịng kẽ thấy rõ
Các đặc điểm sinh hĩa khác được thực hiện theo tác giả Trần Linh Thước [14] và MacFaddin, J.F. [65], các đặc điểm sinh hĩa được khảo sát bao gồm:
– Phát hiện hoạt tính catalase, – Phát hiện hoạt tính oxidase,
– Khả năng lên men (các loại đường được sử dụng glucose, maltose, lactose, galactose, sucrose, raffinose, trehalose),
– Khả năng phân giải Bile esculin, – Khả năng biến dưỡng citrate, – Khả năng biến dưỡng malonate, – Thử nghiệm decarboxylase, – Thử nghiệm urease,
– Khả năng sinh H2S, – Khả năng sinh indol, – Thử nghiệm KIA, TSI,
– Thử nghiệm nitratase (khử nitrate), – Thử nhiệm ONPG,
– Thử nghiệm Methyl Red (MR), – Thử nghiệm Voges – Proskauer (VP) – Khả năng di động.
2.3.8.2. Các đặc điểm phân loại nấm men [9], [10], [14], [61] a. Khảo sát đặc điểm hình thái nấm men
Hình thái của tế bào sinh dưỡng
Sau khi phân lập và làm thuần chúng ta cần kiểm tra các đặc điểm hình thái của tế bào nấm men qua các đặc điểm về hình dạng, kích thước và kiểu sinh sản.
Tế bào nấm men cĩ nhiều hình dạng khác nhau như: hình trịn, hình trứng, hình bầu dục, hình que,…
Về kích thước, nấm men là tế bào cĩ kích thước lớn, lớn hơn tế bào vi khuẩn (5 – 10) lần. Tế bào nấm men thường cĩ chiều dài (9 – 10) µm, chiều rộng (2 – 7) µm.
Cách thực hiện
– Nuơi tế bào nấm men trong mơi trường YM broth ở nhiệt độ phịng trong khoảng (24 – 48) giờ.
– Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi, chú ý các đặc điểm về hình dạng, kích thước, kiểu sinh sản, tế bào thường ở dạng đơi hay tạo chùm.
Hình thái khuẩn ty giả
Ở một số lồi nấm men, chồi trưởng thành khơng tách ra khỏi tế bào mẹ mà tạo thành một chuỗi tế bào được gọi là khuẩn ty giả. Cấu tạo của khuẩn ty giả rất
đơn giản bao gồm các tế bào cĩ kích thước và hình dạng tương tự nhau hay chúng chỉ khác nhau do sự kéo dài của tế bào. Tế bào cuối cùng luơn ngắn hơn hay gần
bằng tế bào kế nĩ, hiếm khi thấy khuẩn ty giả cĩ tế bào cuối cùng dài hơn tế bào kế
nĩ. Rất khĩ phân biệt khuẩn ty giả với khuẩn ty thật, để phân biệt ta cĩ thể dựa vào cách quan sát tế bào cuối cùng của chúng. Khuẩn ty thật cĩ độ khúc xạ và tế bào cuối cùng thường dài hơn tế bào cạnh nĩ cịn khuẩn ty giả khơng cĩ độ khúc xạ, khơng thấy rõ vách ngăn giữa các tế bào (giảđốt) và tế bào cuối cùng thường ngắn hơn tế bào cạnh nĩ.
Sự hình thành khuẩn ty giả ở nấm men là do tác động của điều kiện mơi trường nghèo dinh dưỡng, thiếu oxy,…
Cách thực hiện (phương pháp Dalmau)
– Trước tiên, chúng ta cần chuẩn bị lame, lamelle, đĩa petri cĩ giấy lọc ở
dưới và một nắp đĩa Petri nhỏđặt nằm trong đĩa petri đem hấp khử trùng. – Hút nước cất đã hấp khử trùng bơm lên giấy lọc để giữ cho mơi trường
trong đĩa petri khơng bị khơ.
– Hút mơi trường PDA đã hấp khử trùng và đã được làm tan, trải lên miếng lame một lớp thật mỏng và đặt vào đĩa petri trên nắp đĩa Petri nhỏ nằm trong đĩa petri.
– Sau đĩ chờ cho lớp mơi trường PDA khơ, dùng que cấy thẳng cấy một
đường lên miếng lame và đặt miếng lamelle lên chỗ cấy cho thật kín – Gĩi đĩa, ủở nhiệt độ phịng trong vịng một tuần, bổ sung nước vơ trùng
3 ngày một lần để tránh mơi trường thạch bị mất nước
Kết quả
– Quan sát khuẩn ty giả dưới kính hiển vi
Hình thái bào tử nang
Bào tử nang của các loại nấm men rất khác nhau về số lượng bào tử trong nang, hình dạng, màu sắc, kích thước. Số lượng bào tử nang cĩ thể là một hay nhiều hơn nhưng phổ biến nhất là (2 – 4) bào tử. Bào tử nang cĩ nhiều hình dạng như: hình cầu, hình lưỡi liềm, hình mũ, hình tháp nhọn,…bề mặt cĩ thể nhám hay láng.
Sự hình thành bào tử nang cĩ thể được cảm ứng bởi mơi trường ức chế sự
dinh dưỡng cũng hình thành bào tử nang. Cĩ nhiều mơi trường khác nhau sử dụng
để khảo sát bào tử nang của nấm men, nhưng cĩ 3 mơi trường được dùng nhiều là mơi trường Acetate agar, YM agar và 5% Malt extract agar.
Cách thực hiện
– Cấy giống đã hoạt hĩa vào các mơi trường nên trên. – Ủở nhiệt độ phịng 3 tuần
Kết quả
– Quan sát bào tử dưới kính hiển vi
b. Các đặc điểm sinh lý, sinh hĩa của nấm men
Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Cấy các chủng nấm men vào đĩa Petri chứa mơi trường YM agar, ủ ở những nhiệt độ 25 0C; 30 0C; 35 0C; 40 0C; 45 0C. Sau 5 ngày, quan sát sự phát triển khuẩn lạc.
Đồng hĩa các nguồn nitrogen
Nguyên tắc: Nấm men cĩ khả năng sử dụng rộng rãi các nguồn nitrogen.
Khả năng để sử dụng nitrate là một tiêu chuẩn quan trọng trong việc định danh một số giống. Nấm men phát triển với nitrate như là nguồn nitrogen duy nhất, cũng cĩ thể phát triển trên nitrate nhưng sự ngược lại khơng luơn luơn đúng.
Các nguồn nitrogen được dùng để đồng hĩa: KNO3, NaNO3, NaNO2, L- lysine hydrochloride, ethylamine hydrochloride.
Tiến hành: Hút vào ống nghiệm nhỏ 4,5 mL nước cất rồi đem hấp khử
trùng ở 1210C trong 15 phút, bổ sung 0,5 mL dịch lọc các nguồn nitrogen đã lọc vơ trùng trong điều kiện vơ trùng để được nồng độ cuối là 1%.
Tiến hành cấy chủng vào các ống mơi trường bằng que cấy vịng sau đĩ ủ
các ống mơi trường ở 25 0C trong 3 tuần
Kết quả
– Mức độ phát triển của chủng được ước định bằng mắt, thực hiện như
sau: trước tiên cần vortex để trộn đều tế bào, sau đĩ so sánh với cây thước cĩ đường kẻ 0,75 mm.
– +: nếu dịng kẽ bị che khuất hồn tồn – w: nếu dịng kẻ thấy mờ
– –: nếu dịng kẽ thấy rõ
Các kiểm tra sinh hĩa của nấm men như: Lên men các nguồn đường, đồng hĩa các nguồn carbon, phân giải ure, phân giải gelatin,… được thực hiện như phần
định danh vi khuẩn trên.
2.3.8.3. Các đặc điểm phân loại nấm mốc [3], [30], [38], [69], [73], [78], [94] a. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên thạch
Cấy các chủng nấm mốc lên đĩa petri chứa mơi trường Czapek-DOX agar, ủ ở 25 0C. Tiến hành quan sát các đặc điểm của khuẩn lạc trên đĩa thạch sau (3 – 7) ngày ủ.
b. Tạo tiêu bản quan sát nấm dưới kính hiển vi
– Cho một giọt lactophenol (màu xanh) lên một phiến kính sạch (lame) – Sử dụng kim mũi mác lấy một ít tơ nấm mốc cho vào giọt lactophenol – Dùng hai kim mũi mác tách rời nhẹ các sợi khuẩn ty trong giọt dung dịch – Dùng một lá kính sạch (lamelle) đậy nhẹ lên phiến kính
– Đặt tiêu bản lên bàn mang vật và quan sát ở vật kính X40, X100 – Dùng thước đo vi trắc đểđo kích thước sợi nấm, nang bào tử.
c. Làm phịng ẩm quan sát hiển vi
– Đặt vào đáy đĩa petri một tờ giấy thấm, trên đĩ đặt một phiến kính sạch (lame), đậy lại, gĩi giấy và mang hấp tiệt trùng.
– Đun chảy mơi trường PDA đã hấp tiệt trùng.
– Mở hé nắp đĩa petri gần ngọn lửa đèn cồn, đổ mơi trường thạch lên miếng lame (bên trong) sao cho thạch chảy dài một nửa bên của miếng lame. – Khi thạch trên lame đã đơng lại, lấy nước cất tiệt trùng đổ vào phần giấy
thấm cho nước thấm đều tờ giấy (khơng tràn lên lame) – Cấy chủng nấm mốc lên vùng giao giữa mơi trường và lame
– Quan sát cấu tạo hiển vi của nấm mốc sau 2, 3, 4 ngày ủ.
2.3.9. So sánh tính tương đồng [75]:
Hệ số tương đồng di truyền Jaccard (Sj) là một cơng cụ cho phép xác định mức độ giống nhau của hai lồi vi sinh vật. Vì vậy, để xác định mối quan hệ họ
hàng của các chủng thu nhận với các lồi vi sinh vật cùng chi đã được cơng bố thì việc tính tốn giá trị hệ số Sj là cần thiết. Hệ số Sj được tính theo cơng thức sau:
Sj= a/(a+b)
Trong đĩ: a: tổng số các đặc điểm tương đồng ở hai lồi sinh vật b: tổng sốđặc điểm khác biệt ở hai lồi sinh vật
Như vậy, giá trị của hệ số Sj nằm trong khoảng 0,0 đến 1 (hay 0% đến 100%). Nếu hai sinh vật cĩ hệ số Sj từ lớn hơn 0,8 thì chúng cĩ khả năng cùng một lồi.
2.3.10.Phân tích vật liệu di truyền
Để củng cố thêm các kết quả định danh dựa vào khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh hố, chúng tơi tiến hành phân tích vật liệu di truyền nhằm đưa ra các kết luận vềđịnh danh các chủng vi sinh vật một cách chính xác nhất.
2.3.10.1.Quy trình thu nhận DNA
Quy trình được xây dựng trên quy trình của tác giả Rogers S. O. và cộng sự
(1994) [77]. Quy trình này sử dụng CTAB để phá màng tế bào và chất này phải
được loại bỏ hồn tồn trong hỗn hợp DNA thu được. Quy trình được tiến hành theo các bước sau [8], [77]:
− Hút 1 mL dung dịch sau khi tăng sinh (vi khuẩn, nấm men) vào eppendoft 1,5 mL, ly tâm 6000 vịng/ phút trong 5 phút, thu sinh khối.
− hay cân khoảng 100 mg sợi nấm mốc đã được nghiền trong Nitơ lỏng vào eppendoft 1,5 mL
− Bổ sung 600 µL CTAB nĩng, vortex, ủ 650C trong 60 phút.
− Ly tâm 13000 vịng/ phút trong 5 phút, thu dịch nổi
− Biến tính bằng 500 µL dung dịch phenol:chloroform (1:1), lắc nhẹ
− Ly tâm 13000 vịng/ phút trong 5 phút, thu dịch nổi
− Tủa DNA bằng 1 mL cồn tuyệt đối lạnh
− Ly tâm 13000 vịng/phút trong 30 phút ở 40C, thu tủa DNA
− Rửa tủa bằng 250 µL cồn 700
− Ly tâm 13000 vịng/phút trong 15 phút ở 40C, thu tủa DNA
− Phơi mẫu cho khơ cồn
− Hồ tan tủa trong 20 μL dung dịch TE 0,1X
− Bổ sung 20 μL dung dịch RNase (1 mg/mL), ủ 370C trong 60 phút.
− Giữở 40C
Chất lượng DNA của từng quy trình tách chiết được đánh giá theo các tiêu chí: tính nguyên vẹn của DNA khi điện di trên gel agarose 1%. Độ tinh sạch được
đánh giá thơng qua tỉ số OD260nm / OD280nmvà nồng độ DNA được xác định bằng máy UV – VIS spectrometer, Biomate 5 theo cơng thức sau:
CDNA = F. (OD260 – OD320). 37 Trong đĩ:
CDNA: Nồng độ DNA thu được. F: Độ pha lỗng OD260: Giá trị OD ở bước sĩng 260 nm. 37: Hệ số chuyển đổi. OD320: Giá trị OD ở bước sĩng 320 nm.
2.3.10.2.Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn trong định danh vi khuẩn
Chúng tơi sử dụng cặp mồi 27F/1525R để khuếch đại tồn bộ trình tự rDNA 16S cĩ kích thước khoảng 1500 base. Sau đĩ đoạn sản phẩm này sẽđược giải trình tự bằng 6 mồi khác nhau, các mồi sử dụng được thể hiện trong Bảng 2.2 [8]
Bảng 2.2: Các cặp mồi dùng trong khuếch đại và giải trình tự rDNA 16S
Kí hiệu
mồi Trình tự mồi
Vị trí tương ứng với 16S rDNA ở
E. coli
27F*,+ 5’-AgA gTT TgA TCM Tgg CTC Ag-3’ 9-27
520F+ 5’-CAg CAg CCg Cgg TAA TAC-3’ 519-536
Kí hiệu mồi Trình tự mồi Vị trí tương ứng với 16S rDNA ở E. coli 520R+ 5’-gTA TTA CCg Cgg CTg CTg-3’ 536-519
920R+ 5’-CCg TCA ATT CAT TTg AgT TT-3’ 926-907
1525R*,+ 5’-AAg gAg gTg WTC CAR CC-3’ 1509-1492
F: mồi xuơi; R: mồi ngược; *: sử dụng trong PCR khuếch đại trình tự, +: sử dụng trong PCR giải trình tự.
Thành phần phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3: Thành phần thực hiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự rDNA 16S. Thành phần Nồng độ cuối Thể tích cho mỗi phản ứng (μL) - Nước - Đệm PCR 10X (khơng chứa MgCl2) - Dung dịch MgCl2, 25 mmol/L - Dung dịch dNTPs, 10 mmol/L - Mồi xuơi (27F), 5 μmol/L - Mồi ngược (1525R), 5 μmol/L
- Taq DNA polymerase, 5 IU/μL
- DNA khuơn,100 ng/μL 1X 1,5 mmol/L 0,8 mmol/L 0,2 μmol/L 0,2 μmol/L 2 IU 100 ng 15,6 2,5 1,5 2,0 1,0 1,0 0,4 1,0 TỔNG CỘNG 25,0
Phản ứng được thực hiện với chương trình nhiệt được trình bày trong Bảng 2.4.
Bảng 2.4: Chương trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại trình tự rDNA 16S
Nhiệt độ Thời gian