của chủng W_Q9_Y1 để cĩ thêm thơng tin cho quá trình phân loại và định danh.
3.4.2. Phân tích đoạn trình tự D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA; 25/26/28S) 25/26/28S)
Trước khi chạy PCR chúng tơi tiến hành tách DNA bộ gen để dùng làm khuơn mẫu cho phản ứng PCR, kết quả tách chiết DNA cho thấy DNA bộ gen thu nhận được tốt cho việc thực hiện phản ứng PCR, với các giá trị hấp thu ở các bước sĩng khác nhau lần lượt là: OD260nm=0,472; OD280nm=0,249 và OD320nm=0,004, do
đĩ, DNA thu được cĩ nồng độ là 173,16 ng/μL và độ tinh sạch là OD260/OD280 = 1,90 và độ nguyên vẹn được thể hiện trên Hình 3.12.
Trước khi giải trình tự đoạn D1/D2 chúng tơi tiến hành khuếch đại chúng bằng phản ứng PCR với cặp mồi LR3/F63, đoạn trình tự này cĩ kích thước khoảng 600 bp, sau khi thực hiện phản ứng PCR sản phẩm được thể hiện trên Hình 3.12.
Giếng 1: Sản phẩm sau khi tách DNA
Giếng 2: Thang
Lambda DNA/EcoR
I + Hind III Giếng 1: Thang EZ Load 100 bp Molecular ruler Giếng 2: Sản phẩm khuếch đại trình tự đoạn D1/D2
Kết quả thu nhận DNA bộ gen Sản phẩm khuếch đại trình tựđoạn D1/D2
Hình 3.12: Kết quả thu nhận DNA bộ gen và sản phẩm khuếch đại trình tựđoạn
D1/D2 của chủng W_Q9_Y1
Hình trên cho thấy sản phẩm khuếch đại cĩ vạch nằm tương ứng với chiều dài khoảng 600 bp so với thang chuẩn, như vậy sản phẩm khuếch đại này tương ứng với kích thước đoạn DNA sản phẩm dự kiến.
Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được gửi đi giải trình tự tại cơng ty Macrogen Inc, Hàn Quốc. Kết quả trình tự đoạn D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA; 25/26/28S) của chủng nấm men W_Q9_Y1 (568 bp) được trình bày trong phần Phụ lục V.
Sau khi trình tựđoạn D1/D2 được biết, chúng tơi tiến hành tìm và so sánh độ
tương đồng di truyền của chủng nấm men W_Q9_Y1 trên ngân hàng dữ liệu bằng cơng cụ BLAST tại website: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. Kết quả so sánh độ
tương đồng di truyền của của chủng nấm men W_Q9_Y1 trên ngân hàng dữ liệu
được trình bày trong Phụ lục VI
Từ kết quả so sánh độ tương đồng di truyền của các chủng trên ngân hàng dữ
liệu cho thấy chủng nấm men W_Q9_Y1 thuộc chi Candida và cĩ mối quan hệ gần nhất với lồi Candida rugosaở mức độ tương đồng di truyền là 97%.
Tuy nhiên, để kết luận chủng nấm men W_Q9_Y1 là lồi nào thì cần phải dựa trên cây phát sinh lồi. Bằng phần mềm BioEdit và MEGA cùng với dữ liệu trình tự đoạn trình tự D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA; 25/26/28S rRNA) của các lồi cùng chi trong ngân hàng gen, chúng tơi đã xây dựng cây phát sinh lồi tổng quát được thể hiện trên Hình 3.13.
C.aaseri NRRL YB-3897T (U45802) C.butyri NRRL Y-17648T (U45780) C.insectorum NRRL Y-7787T (U45791) C.conglobata NRRL Y-1504T (U45789) C.tenuis NRRL Y-1498T (U45774)
C.trypodendroni NRRL Y-6488T (AF017240) C.naeodendra NRRL Y-10942T (U45759)
C.dendronema NRRL Y-7781T (U45751) C.diddensiae NRRL Y-7589T (U45750) C.tammaniensis NRRL Y-8257T (AF017243) C.buinensis NRRL Y-11706T (U45778) C.friedric hii NRRL Y-17653T (U45781) C.membranifac iens NRRL Y-2089T (U45792)
C.atlantica NRRL Y-17759T (U45799) C.atmosphaerica NRRL Y-17642T (U45779) C.ins ectamans NRRL Y-7786T (U45753) C.albicans NRRL Y-12983T (U45776)
C.maltosa NRRL Y-17677T (U45745) C.vis wanathii NRRL Y-17317T (U45755)
C.parapsilosis NRRL Y-12969T (U45754) C.sojae NRRL Y-17909T (U71070) C.tropicalis NRRL Y-12968T (U45749) C.peltata NRRL Y-6888T (U71066)
C.populi NRRL Y-17681T (U70249) C.ernobii NRRL Y-17782T (U70241) C.karawaiewii NRRL Y-17784T (U94921) C.c hilensis NRRL Y-7790T (U45821)
C.c ylindracea NRRL Y-17506T (U45823) C.querc itrusa NRRL Y-5392T (U45831)
C.shehatae var. lignosa NRRL Y-12856T (U C.shehatae var. shehatae NRRL Y-12858T ( C.shehatae var. insectosa NRRL Y-12854T
C.ergastensis NRRL Y-17652T (U45746) C.sophiaereginae NRRL Y-17668T (U45817) C.multigemmis NRRL Y-17659T (U45782) C.beechii NRRL Y-17758T (U45798) C.oleophila NRRL Y-2317T (U45793) C.natalensis NRRL Y-17680T (U45818)
C.zey lanoides NRRL Y-1774T (U45832) C.psy chrophila NRRL Y-17665T (U45813) C.laureliae NRRL Y-17656T (U45787) C.ralunensis NRRL Y-17666T (U45786) C.boleticola NRRL Y-17080T (U45777) C.schatavii NRRL Y-17078T (U45795)
C.fermentic arens NRRL Y-17321T (U45756) C.fragi NRRL Y-17910T (U71071)
C.fukuyamaensis NRRL Y-17857T (U62311) C.glaebosa NRRL Y-6949T (U45757) C.palmioleophila NRRL Y-17323T (U45758)
C.saitoana NRRL Y-17316T (U45762) C.fluviatilis NRRL Y-7711T (U45717) C.pseudoglaebosa NRRL Y-17911T (U71072)
C.glucosophila NRRL Y-17781T (U45849) C.castrensis NRRL Y-17329T (U45807) C.paludigena NRRL Y-12697T (U45826) C.valdiviana NRRL Y-7791T (U45835)
C.bertae NRRL Y-17643T (U70251) C.cantarellii NRRL Y-17650T (U45814) C.santjacobens is NRRL Y-17667T (U45811)
C.tepae NRRL Y-17670T (U45816) C.ancudensis NRRL Y-17327T (U45810) C.petrohuensis NRRL Y-17663T (U45819)
C.berthetii NRRL Y-17644T (U62298) C.dendric a NRRL Y-7775T (U62301)
C.norvegica NRRL Y-17660T (U62299) C.montana NRRL Y-17326T (U62305) C.stellimalicola NRRL Y-17912T (U84234) C.nitrativorans CBS 6152T (AJ508573)
C.s ilvicultrix NRRL Y-7789T (U69879) C.quercuum NRRL Y-12942T (U70184)
C.maritima NRRL Y-17775T (U69877) C.vartiovaarae NRRL Y-6701T (U69875) C.solani NRRL Y-2224T (U70179)
C.vini NRRL Y-1615T (U70247) C.pignaliae NRRL Y-17664T (U70183) C.arabinofermentans NRRL YB-2248T (AF017
C.ovalis NRRL Y-17662T (U70248) C.sithepensis S023T (AB120220)
C.boidinii NRRL Y-2332T (U70242) C.ooitensis NRRL Y-17661T (U94926) C.sonorensis NRRL Y-7800T (U70185)
C.methanosorbosa NRRL Y-17320T (U70186) C.pini NRRL Y-2023T (U70252)
C.llanquihuensis NRRL Y-17657T (U70190) C.suc ciphila NRRL Y-11998T (U70189) C.nemodendra NRRL Y-7779T (U70246)
C.c arios ilignicola NRRL Y-11996T (U70188 C.k rabiensis N051T (AB120219)
C.maris NRRL Y-6696T (U70181) C.nitratophila NRRL YB-3654T (U70180) C.kruisii NRRL Y-17087T (U45718)
C.austromarina NRRL Y-17769T (U62310) C.sake NRRL Y-1622T (U45728)
C.sequanensis NRRL Y-17682T (U45711) C.tanzawaensis NRRL Y-17324T (U44811)
C.entomophila NRRL Y-7783T (U62302) C.silvanorum NRRL Y-7782T (U71068) C.ontarioens is NRRL YB-1246T (AF017244) C.fennic a NRRL Y-7505T (U45715)
C.homilentoma NRRL Y-10941T (U45716) C.gotoi CBS 8531T (AY489112) C.rhagii NRRL Y-2594T (U45729) C.hasegawae NBRC 102566T (AB306510)
C.kazuoi NBRC 102565T (AB306509) C.s orbophila NRRL Y-7921T (U45852)
C.galac ta NRRL Y-17645T (U45820)
C.pararugosa NRRL Y-17089T (U62306) C.s pandovensis NRRL Y-17761T (U62309)
C.az yma NRRL Y-17067T (U62312) C.vanderwaltii NRRL Y-17671T (U62313) C.auringiensis NRRL Y-17674T (U62300)
C.s almanticensis NRRL Y-17090T (U62308) C.blankii NRRL Y-17068T (U45704)
C.pseudolambic a NRRL Y-17318T (U71063) C.rugopellic ulos a NRRL Y-17079T (U71069) C.incons picua NRRL Y-2029T (U71062)
C.ethanolica NRRL Y-12615T (U71073) C.s ilvae NRRL Y-6725T (U71065)
C.haemulonii DMST 17134T (AB118792) C.haemulonii NRRL Y-6693T (U44812) C.s ilvatic a NRRL Y-7777T (U76201)
C.versatilis NRRL Y-6652T (U45834) C.geochares NRRL Y-17073T (U48591) C.magnoliae NRRL Y-2024T (U45722)
C.apis NRRL Y-2482T (U48237) C.vaccinii NRRL Y-17684T (U45708) C.gropengiesseri NRRL Y-1445T (U45721)
C.etchellsii NRRL Y-17084T (U45723) C.stellata NRRL Y-1446T (U45730)
C.lactis condensi NRRL Y-1515T (U45724) C.apicola NRRL Y-2481T (U45703) C.bombi NRRL Y-17081T (U45706)
C.floric ola NRRL Y-17676T (U45710) C.mogii NRRL Y-17032T (U44820)
C.k ofuensis CBS 8058T (AF158019) C.oregonensis NRRL Y-5850T (U44815) C.torresii NRRL Y-6699T (U45731) C.fruc tus NRRL Y-17072T (U44810)
C.melibios ica NRRL Y-17076T (U44813) C.tsuchiyae NRRL Y-17840T (U49064) C.intermedia NRRL Y-981T (U44809) C.pseudointermedia NRRL Y-10939T (U44816
C.incommunis NRRL Y-17085T (U62303) C.savonica NRRL Y-17077T (U62307) C.catenulata NRRL Y-1508T (U45714)
C.mesenterica NRRL Y-1494T (U45720) C.suec ica NRRL Y-12943T (U45732)
C.ins ectalens NRRL Y-7778T (U62304) C.rugos a NRRL Y-95T (U45727)
W Q9 Y1 4 9 4 5 1 0 0 4 0 5 4 3 5 2 5 9 9 1 0 0 9 4 1 0 0 1 0 0 7 8 4 2 1 0 0 1 0 0 9 2 9 6 5 3 5 3 4 1 4 7 4 3 4 7 2 5 6 4 2 7 1 3 4 6 4 1 5 4 1 3 9 2 3 9 9 3 4 3 0 1 0 0 9 9 2 9 7 4 4 3 4 1 4 2 0 2 8 1 8 3 6 2 5 9 9 1 0 0 3 0 9 6 6 7 2 8 2 2 7 2 4 5 5 3 3 1 7 2 7 6 0 4 4 4 3 9 8 5 6 7 6 9 8 8 3 6 0 6 6 3 1 5 2 0 2 7 3 7 8 6 6 1 8 9 7 1 6 7 1 4 4 4 5 8 9 6 3 6 9 5 6 4 9 8 7 5 4 7 9 9 3 6 6 1 1 5 1 4 4 4 2 4 1 8 1 4 7 7 3 4 1 2 1 6 7 2 2 2 3 0 2 9 7 0 1 9 5 1 1 3 8 2 4 9 3 5 5 0 0 3 2 9 7 2 0 0 3 7 1 8 0 0 1 2 4 5 5 4 0 13 1 0 4 1 1 0.02
Hình 3.13: Cây phát sinh lồi tổng quát của chủng W_Q9_Y1 với các chủng khác
Tuy nhiên, số lượng lồi sử dụng ở cây phát sinh lồi tổng quát là rất nhiều vì thế sau khi xử lý bằng phần mềm BioEdit thì số trình tự dùng để so sánh là tương
đối thấp (khoảng 300 nucleotide). Do đĩ, kết quả ở cây phát sinh lồi tổng quát chưa thể hiện chính xác kết quả. Vì thế, chúng tơi tiếp tục dựng cây phát sinh lồi chi tiết cho chủng W_Q9_Y1 với các lồi so sánh là các lồi trong cùng nhánh, cĩ mối quan hệ họ hàng gần nhất với chủng khảo sát. Kết quảđược thể hiện trên Hình 3.14.
C.mesenterica NRRL Y-1494T (U45720) C.suecica NRRL Y-12943T (U45732)
C.savonica NRRL Y-17077T (U62307) C.catenulata NRRL Y-1508T (U45714)
C.fragi NRRL Y-17910T (U71071) C.incommunis NRRL Y-17085T (U62303) C.rugosa NRRL Y-95T (U45727)
W Q9 Y1
C.insectalens NRRL Y-7778T (U62304) 1 0 0 8 4 9 5 9 2 4 5 3 4 0.05
Hình 3.14: Cây phát sinh lồi chi tiết của chủng W_Q9_Y1 với các chủng khác
trong chi Candida (số trình tự so sánh là 409 nucleotide).
Đối với cây phát sinh lồi chi tiết, trình tự sau khi xử lý được dùng để so sánh lớn hơn 400 nucleotide. Vì vậy, kết quả này đáng tin cậy.
Dựa vào kết quả so sánh trình tự đoạn D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA; 25/26/28S) ta cĩ thể kết tạm kết luận chủng W_Q9_Y1 gần giống với
lồi Candida rugosa. Tuy nhiên, để cĩ thể kết luận, chúng tơi tiến hành so sánh các
đặc điểm về sinh thái và các đặc tính sinh lý, sinh hĩa để tính hệ số tương đồng Jaccard của chủng W_Q9_Y1 với chủng Candida rugosa (được trình bày trong
Bảng B, Phụ lục VII), Kết quả tính hệ số tương đồng Jaccard như sau:
¾ Chủng W_Q9_Y1 với chủng Candida rugosa cĩ hệ số tương đồng là: 91,89% (34/37). Do đĩ, cĩ thể kết luận chủng W_Q9_Y1 là lồi
Như vậy, từ các kết quả khảo sát về các đặc điểm về sinh thái, các đặc tính sinh lý, sinh hĩa của chủng W_Q9_Y1, kết quả so sánh trình tựđoạn D1/D2 và hệ số tương đồng Jaccard thì ta cĩ thể kết luận chủng W_Q9_Y1 phân lập
được là lồi Candida rugosa.