2.3.6.1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sĩng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm cĩ bước sĩng hấp thu cực
đại ở 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sĩng 595 nm. Độ hấp thu ở bước sĩng 595 nm cĩ liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ
protein.
2.3.6.2. Phương pháp
Xây dựng đường chuẩn (chú ý rửa sạch cuvette bằng cồn, tráng lại bằng nước cất khi thay đổi mẫu đo).
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ albumin (µg/mL) 1 10 20 30 40 50
Dung dịch albumin 0,1 mg/mL 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
ddH2O (mL) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
− Thực hiện hai lơ thí nghiệm, mỗi lơ sáu ống nghiệm đánh số theo thứ tự
Thí nghiệm 1 0a 1a 2a 3a 4a 5a
Thí nghiệm 2 0b 1b 2b 3b 4b 5b
− Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian ở phút thứ 0 cho 5 mL dung dịch thuốc thử Bradford vào ống nghiệm 0a, lắc đều, để yên.
− Ở thời điểm phút thứ 1, cho 5 mL dung dịch thuốc thử Bradford vào ống nghiệm 0b, lắc đều, để yên. Tiếp tục tiến hành tuần tự cho các ống nghiệm cịn lại theo thứ tự tiếp theo là 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5a
đến thời điểm phút thứ 11 cho 5 mL dung dịch thuốc thử Bradford vào
ống nghiệm 5b, lắc đều và để yên.
− Khi ống nghiệm 0a được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch
ở bước sĩng 595 nm.
− Tuần tựđo OD595nm các ống nghiệm tiếp theo với thời gian giãn cách là 1 phút theo thứ tự 0b, 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5a và 5b.
− Lấy giá trị OD trung bình của hai ống nghiệm a và b.
− Lấy OD595nm của ống thử thật trừ OD595nm của ống thử khơng ta được
ΔOD595nm.
− Vẽđường tuyến tính giữa nồng độ albumin và ΔOD595nm.
− Xác định hàm lượng protein tổng trong mẫu: tiến hành tương tự với thời gian phản ứng là 20 phút. Mẫu được pha lỗng sao cho ΔOD595nm đo
2.3.6.3. Tính kết quả
Hàm lượng protein trong 1 mL dịch enzyme được tính theo cơng thức: P = a.10-3.n (mg protein/mL)
Với:
P: Hàm lượng protein trong 1 mL dịch enzyme mẫu (mg protein/ mL). a: Nồng độ protein trong mẫu suy ra từđường chuẩn (µg/mL)
n: Hệ số pha lỗng.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});