Enzyme lipase cần thu nhận là dạng enzyme ngoại bào nên ta dùng phương pháp lọc để loại bỏ sinh khối bằng giấy lọc cĩ đường kính lỗ là Φ=110 mm, sau đĩ lọc qua màng lọc cĩ kích thước lỗΦ=0,45 μm để thanh trùng dịch lọc. Dịch lọc thu nhận được bảo quản ở 4 0C để bảo vệ hoạt tính enzyme. Enzyme được tủa bằng ethanol 96 0, quy trình được thực hiện như sau [7]:
– Tủa protein bằng ethanol 960 với tỷ lệ 1:4
– Khuấy đều và cho từ từ ethanol 960 lạnh vào dịch lọc. Quá trình tủa được giữở 40C và để qua đêm.
– Tiến hành ly tâm với tốc độ 10 000 vịng/phút trong 10 phút ở 4 0C. – Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa với ethanol 70 0.
– Ly tâm với tốc độ 10 000 vịng/phút trong 10 phút ở 4 0C. – Loại bỏ dịch nổi, để khơ tự nhiên
– Hịa tan với nước cất tiệt trùng sao cho hàm lượng protein theo phương pháp Bradford nằm trong khoảng (0,1 – 0,2) mg/mL.
– Chế phẩm enzyme được bảo quản ở nhiệt độ dưới 0 0C.
2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính lipase
2.3.5.1. Xác định hoạt tính enzyme lipase [7], [23], [39], [56], [63], [74].
Hoạt tính enzyme lipase được xác định dựa trên phương pháp định phân lượng acid béo tự do được tạo ra với cơ chất là dầu olive nhũ hĩa.
Hỗn hợp phản ứng gồm:
Dầu olive nhũ hĩa...5,0 mL Dung dịch Soresen 50 mM pH 7,0 ...4,0 mL Dịch enzyme...1,0 mL
Phản ứng được tiến hành trong 30 phút ở 300C trên máy lắc ủ ổn nhiệt với tốc độ 160 vịng/phút.
Bổ sung 15 mL hỗn hợp aceton:ethanol (1:1 v/v) để dừng phản ứng. Thêm 10 mL dung dịch NaOH N/20, lắc đều và định phân lượng NaOH dư bằng HCl N/20 với chất chỉ thị màu phenolphtalein 1%.
Mẫu đối chứng: được tiến hành như trên nhưng dịch enzyme đã được làm bất hoạt bằng cách đun dịch enzyme ở 100 0C trong 10 phút.
2.3.5.2. Kết quả tính tốn
Một đơn vị hoạt tính (UI) được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác để giải phĩng một μmol acid béo trong một phút.
Hoạt tính lipase (UI/mL) được tính theo cơng thức:
( ) UI mL t f V V V A 50× 0 − T × × , / = Trong đĩ: A: Hoạt tính lipase (UI/mL)
50: Sốμmol acid tương ứng với 1 mL dung dịch HCl N/20. V0: thể tích (mL) dung dịch HCl N/20 dùng ở mẫu đối chứng. VT: thể tích (mL) dung dịch HCl N/20 dùng ở mẫu thật. V: Thể tích (mL) hỗn hợp phản ứng (V = 10 mL)
f: hệ số hiệu chỉnh của dung dịch HCl N/20. t: Thời gian (phút) phản ứng (t = 30).