3.1.1. Kết quả nghiên cứu lựa chọn chủng và môi trường lên men thích hợp
Muốn thu nhận sản phẩm enzyme có chất lượng và hiệu suất cao thì việc chọn giống và môi trường nuôi cấy có ý nghĩa quyết định. Tiến hành so sánh dựa
trên 3 chủng Micromonospora được lấy từ Viện Vi sinh vật và Công Nghệ sinh học
(VTCC) - Trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Sau khi 3 ngày nuôi trong môi trường thạchYS, khuẩn lạc được cấy trong các môi trường nuôi cấy tổng hợp là Gause-I, ISP-4 và YS có 0,5% CMC làm chất cảm ứng ở 30ºC, pH 7,0 lắc 180v/phút, sau 72 giờ ly
tâm thu dịch nổi nuôi cấy. Định tính hoạt tính cellulase của 3 chủng Micromonospora này
được thể hiện mạnh trên đĩa thạch theo hình 3.1 và bảng 3.1 sau:
Bảng 3.1. Định tính cellulase của 3 chủng Micromonospora sau 3 ngày
Hoạt tính cellulase tương đối (D-d, mm) STT Ký hiệu chủng Gause-I ISP-4 YS 1 VTCC-A-1787 5 15 9 2 VTCC-A-1762 8 10 6 3 VTCC-A-1820 7 8 4 (a) (b)
(c) (c’)
Hình 3-1. Vòng phân giải cơ chất của chủng Micromonospora sau 3 ngày
VTCC-A-1762; (b) VTCC-A-1820; (c & c’) VTCC-A-1787
Mục đích của việc tuyển chọn là chọn ra giống Micromonospora có khả năng
tạo enzyme cellulase có hoạt tính cao nhất. Từ kết quả thực nghiệm bảng 3.1 và quan sát hình 3-1 ta thấy khi nuôi cấy 3 chủng ở trên 3 môi trường khác nhau thì trên đĩa thạch đều xuất hiện vòng phân giải cơ chất CMC với đường kính vòng phân giải rất
khác nhau. Như vậy, các chủng Micromonospora được khảo sát đều có sinh ra cellulase ngoại bào. Cụ thể chủng Micromonospora VTCC-A-1787 đạt vòng phân giải lớn nhất ở môi trường ISP-4 với đường kính 15mm, còn chủng Micromonospora VTCC-A-1762 đạt đường kính 10mm và Micromonospora VTCC-A-1820 đạt 8mm
ở cùng môi trường.
Kết quả trên cho thấy môi trường ISP-4 thích hợp cho cả 3 chủng xạ khuẩn này và chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có hoạt tính tương đối cao nhất. Như vậy, các xạ khuẩn tuy cùng một chi có cấu tạo tương đương nhau nhưng khác giống được nuôi cấy trong cùng một môi trường thì khả năng sinh enzyme là khác nhau và mỗi chủng chỉ thích hợp với 1 loại môi trường nuôi cấy sinh enzyme nhất định.
Dựa vào kết quả sơ bộ bằng phương pháp định tính enzyme cellulase trên
đĩa thạch, khả năng sinh tổng hợp cellulluase từ 3 chủng Micromonospora này trên
môi trường ISP-4 được xác định cụ thể bằng phương pháp định lượng. Sau 72 giờ
nuôi cấy chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có khả năng sinh C-DC có hoạt
tính cellulase cao nhất đạt 92 UI/ml. Kết quả được trình bày theo bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 3 chủng Micromonospora sau 3 ngày Chủng Hoạt tính (UI/ml) VTCC-A-1787 92,0 ± 0,011 VTCC-A-1762 64,8 ± 0,05 VTCC-A-1820 58,4 ± 0,025
Như vậy, mỗi vi sinh vật sinh trưởng và phát triển phù hợp với mỗi loại môi trường khác nhau nên khả năng sinh tổng hợp enzyme khác nhau.
Từ kết quả trên, chọn chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase cao nhất trong số 3 chủng Micromonospora nghiên cứu (Bảng 3.1, 3.2; Hình 3-1) theo phương pháp nuôi cấy lỏng trong môi trường ISP-4 sau 3 ngày nuôi cấy. Do đó, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được chọn để tối ưu các điều kiện nuôi cấy và tinh sạch, đánh giá tính chất lý hóa của enzyme cellulase.
3.1.2. Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Micromonospora VTCC-A-1787 3.1.2.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý hóa 3.1.2.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý hóa
a. Quan sát đại thể: Khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch đĩa YS có màu cam, tròn đều và nhỏ, đường kính khuẩn lạc khoảng 0,7÷1mm, bề mặt xù xì và khô, cắm sâu vào môi trường thạch.
b. Đặc điểm sinh lý hóa: Tiến hành thử các phản ứng sinh hóa, kết quả được trình bày ở bảng 3.3:
Bảng 3.3. Mô tả đặc điểm sinh lý hóa Micromonospora echinospora
Các chỉ tiêu Mô tả
Khả năng hình thành enzyme ngoại bào (D-d, mm) trên môi trường ISP-4
+ Amylase trên cơ chất tinh bột
+ Protease trên cơ chất casein thủy phân
8 13
Khả năng chịu muối tối đa (%) 3
Khả năng phân giải carbohydrate + Glucose + Fructose + Manitol + Sucrose + Lactose + + - + + (+): Có phản ứng; (-): Không có phản ứng
Qua bảng 3.3 cho thấy chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có khả năng
lên men và sử dụng 4 nguồn đường là glucose, fructose, lactose và sucrose tạo các acid hữu cơ, các rượu, CO2 làm thay đổi pH của môi trường, dẫn đến thay đổi màu của chất chỉ thị. Chất chỉ thị phenol red từ màu đỏ chuyển sang vàng, đối chứng (+); đối với các loại đường còn lại không có khả năng đồng hóa nên có màu đỏ, đối chứng
(-) theo hình 3-3.
- Nồng độ muối có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn. Kết
quả cho thấy chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có khả năng sử dụng nồng độ
muối tới 3% và ở nồng độ muối cao hơn thì chủng không phát triển được. Như vậy ở nồng độ muối 0,5% có tác dụng kích thích sự sinh trưởng chủng xạ khuẩn
Micromonospora VTCC-A-1787.
- Trong quá trình sống, để phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất đơn giản có thể hấp thu được, xạ khuẩn có khả năng tiết vào môi trường các enzyme ngoại bào. Sau khi tiến hành kiểm tra, kết quả cho thấy chủng
Micromonospora VTCC-A-1787 còn có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease và
amylase thủy phân mạnh casein, tinh bột.
3.1.2.2. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm nuôi cấy
a. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng Micromonospora VTCC- A-1787
Tiến hành nuôi cấy chủng Micromonospora VTCC-A-1787 trong 3 môi
trường khác nhau là YS, ISP-4, Gause-I ở nhiệt độ 30oC, pH 7,0. Xác định giá trị mật độ quang ở bước sóng 620nm (A620nm) ở các thời điểm nhau từ 24÷168 giờ. Kết quả cho thấy chủng có tốc độ phát triển khác nhau trong các môi trường khác nhau, do khả năng thích ứng và sử dụng dinh dưỡng trong môi trường khác nhau ở các giai đoạn nuôi cấy khác nhau. Đường cong sinh trưởng trong 3 môi trường nuôi cấy ở các thời điểm khác nhau được biểu diễn theo bảng 1 (phụ lục 2) và hình 3-4:
Quan sát đường cong sinh trường hình 3-4 cho thấy trong điều kiện nuôi cấy liên tục và không thay đổi môi trường nếu thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dưỡng càng giảm sút, các chất phế thải của trao đổi chất càng
tăng lên, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 sinh trưởng và phát triển qua 4
pha liên tiếp bao gồm: pha lag, pha logarit, pha cân bằng và pha suy vong.
Trong giai đoạn tiềm phát (pha lag), XK chưa phân chia nhưng trọng lượng và thể tích tế bào tăng rõ rệt trong thời kì này vì khi cấy chuyển từ môi
trường thạch sang môi trường lỏng, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 bắt
đầu thích nghi và làm quen với môi trường mới, sau đó chúng sẽ cảm ứng và sinh ra các loại enzyme phân giải thành phần môi trường. Dựa vào hình 3-4 cho thấy, pha lag tính từ khi bắt đầu cấy chuyền, giai đoạn này là sau 24h ở MT YS với mật độ tế bào (OD620nm) cao nhất đạt 0,514, ở MT ISP-4 sau 39h là 0,489, ở MT Gause-I là sau 48 giờ đạt 0,651.
Đến giai đoạn logarit (pha log), mật độ tế bào tăng đột ngột vì các enzyme do VSV tiết ra bắt đầu phân giải các thành phần nuôi cấy sẵn có, làm MT trở nên giàu chất dinh dưỡng và ổn định, các thành phần này được tổng hợp với tốc độ đều giúp quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ nhất. Các tế bào trong pha này còn non, sinh trưởng và tăng sinh khối nhanh, số lượng tế bào tăng, kích thước của tế bào, thành phần hóa học, hoạt tính sinh lý không thay đổi theo thời gian. Cụ thể mật độ tế bào pha logarit ở MT ISP-4 đạt cao nhất trong khoảng thời gian từ sau 39÷72h (OD620nm = 0,689÷1,554), ở MT YS từ 24÷63h (OD620nm = 0,714÷1,345), ở MT Gause-I từ sau 48÷96h (OD620nm = 0,651÷1,297).
Bước sang giai đoạn ổn định (pha cân bằng) thì tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng trao đổi chất bắt đầu giảm, số lượng tế bào chết đi cân bằng với số tế bào sinh ra. Một số nguyên nhân khiến chuyển sang pha cân bằng chủ yếu là do chất dinh dưỡng bị cạn kiệt, hay một số chất dinh dưỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng, khiến sự sinh trưởng sẽ chậm lại, nồng độ oxy hòa tan trong nước giảm, sự tích lũy của các sản phẩm trao đổi chất có hại như các loại rượu, acid lactic hay các acid hữu cơ làm acid hóa môi trường, làm pH thay đổi gây ức chế sự sinh trưởng của VSV. Theo số liệu đo được theo bảng 3-4 và hình 3-4,
OD620nm ở pha cân bằng cao hơn so với các pha khác, độ đục lúc này có thể vừa
bao gồm sinh khối, xác tế bào và cả những sản phẩm trao đổi chất. Qua đó, ta có thể thấy mật độ tế bào ở các môi trường giảm dần, cụ thể ở MT ISP-4 từ
72÷144h nuôi cấy giảm từ 1,554 còn 1,247; ở MT YS sau 63÷120h giảm từ 1,345 còn 1,21; ở MT Gause-I sau 96÷120h giảm từ 1,297 còn 1,015.
Ở pha suy vong thì số lượng tế bào sống giảm do giảm thiểu chất dinh dưỡng, sản phẩm bài tiết quá nhiều và việc tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm tổn thất đến môi trường sống của VSV, làm cho VSV chết đi và tự phân hủy nhờ các enzyme của bản thân. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, mật độ TB ở MT ISP- 4 giảm sau 6 ngày, ở MT YS và Gause-I sau 5 ngày.
Như vậy, chủng xạ khuẩn Micromonospora VTCC-A-1787 được hoạt hóa trên môi trường ISP-4, thời điểm thu sinh khối tốt nhất là sau 72 giờ (cuối pha log, đầu pha cân bằng), chủng phát triển tốt và hoạt tính sinh lý cao được lấy bổ sung giống vào môi trường nuôi cấy sinh enzyme với tỷ lệ 10%.
b. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy
Trong môi trường nước luôn tồn tại một lượng khí hòa tan rất nhỏ. Tuy số lượng các chất khí này không cao nhưng chúng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của các VSV có trong môi trường nước. Nhu cầu oxy của các VSV trong nước hoàn toàn không giống nhau. Có những loài cần ít oxy, có những loài cần nhiều oxy và cũng có những loài không cần oxy để sống (Nguyễn Đức Lượng & Nguyễn Thị Thùy Dương, 2003).
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy trong môi trường
ISP-4 ở 2 chế độ: nuôi cấy động (lắc 180v/phút) và nuôi cấy tĩnh (không lắc) ở nhiệt độ phòng 30oC, pH 7,0 có bổ sung 0,5% CMC. Quan sát màu sắc môi trường (a) và hoạt tính của C-DC (b) sau 5 ngày nuôi cấy ta có kết quả như hình 3-5 sau:
(a) (b)
Hình 3-5. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy đến hoạt tính cellulase của chủng
Ở môi trường nuôi cấy động, nhận thấy màu sắc môi trường có màu cam
(trùng màu khuẩn lạc) rất đậm, chứng tỏ chủng Micromonospora VTCC-A-1787
phát triển rất tốt với đường kính thủy phân CMC lớn hơn so với môi trường nuôi cấy tĩnh. Kết quả này là do nuôi cấy VSV ở chế độ lắc giúp tạo ra oxy hòa tan, là điều kiện cần để hô hấp tế bào, tạo năng lượng cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp protein, enzyme và từ đó tăng sinh tế bào. Đồng thời giúp tạo ra oxy hòa tan phân bố đều làm tăng quá trình trao đổi khí giữa môi trường bên trong và bên trên môi trường nuôi cấy, giúp các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và các tế bào VSV được phân bố đều trong môi trường, làm tăng trao đổi chất dinh dưỡng giữa tế bào VSV và môi trường.
Như vậy, dựa vào những lý do trên nên chủng Micromonospora VTCC-A- 1787 được tiến hành nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme cellulase theo phương pháp nuôi cấy động với chế độ lắc 180v/phút.
3.2. Xác định các điều kiện môi trường tối ưu sinh tổng hợp cellulase của chủng
Micromonospora VTCC-A-1787
3.2.1. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase theo thời gian
Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp cellulase theo thời gian, chủng
Micromonospora VTCC-A-1787 được hoạt hóa trong môi trường ISP-4 ở 30oC, lắc 180v/phút, pH 7,0. Sau 3 ngày bổ sung giống với tỷ lệ 10% vào môi trường có 0,5% CMC. Dịch enzyme được thu ở các khoảng thời gian khác nhau từ 24÷168h để xác định hoạt tính tương đối. Kết quả cho thấy, trên đĩa thạch xuất hiện các vòng phân giải cơ chất CMC với đường kính khác nhau (hình 3-5), đồng thời khả năng
sinh tổng hợp cellulluase từ chủng Micromonospora VTCC-A-1787 trên môi
trường ISP-4 cũng được định lượng và định tính (bảng 2, phụ lục 2 và hình 3-6).
Trong điều kiện nuôi cấy, toàn bộ quá trình sinh trưởng của VSV gắn liền với sự thay đổi theo thời gian. Trong môi trường, các chất dinh dưỡng theo thời gian sẽ giảm, và tương ứng số lượng tế bào VSV sẽ tăng lên, đồng thời hoạt tính trao đổi chất của tế bào cũng thay đổi. Đối với enzyme là loại sản phẩm mà sự hình thành của nó gắn liền với sự sinh trưởng của VSV, sự tổng hợp này xảy ra trong thời gian sinh trưởng và còn có thể tiếp diễn sau khi pha sinh trưởng đã kết thúc.
Hình 3-7. Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo thời gian của chủng
Micromonospora VTCC-A-1787
Sau 24 giờ nuôi cấy, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có khả năng
sinh cellulase với hoạt tính thấp nhất đạt 54,9UI/ml, H = 4mm. Mối liên hệ giữa thời gian nuôi cấy với hoạt tính cellulase không cao là do ở thời gian này XK chưa kịp thích ứng với môi trường mới, số lượng tế bào phát triển chưa nhiều, các sản phẩm trao đổi chất của VSV nuôi cấy ở thời gian kỳ này không có hoặc bắt đầu tích tụ với một số lượng nhỏ, pH của môi trường ban đầu ít thay đổi. Sau 72h, hoạt tính enzyme đạt 89,2UI/ml với H, 15mm do lúc này XK đã dần thích ứng với môi trường mới và bắt đầu phát triển mạnh, nhu cầu nguồn cơ chất tăng cao, XK phải tiết enzyme để phân hủy các chất phức tạp để làm nguồn dinh dưỡng, lượng enzyme tiết ra dần dần tăng lên đồng thời với sự phát triển của chủng VSV đến khi ổn định, thời điểm này pH bắt đầu giảm mạnh do các sản phẩm trao đổi chất như acid hữu cơ, các loại rượu làm thay đổi pH. Hoạt tính enzyme đạt tối đa ở 120 giờ là 129,1UI/ml với H, 18mm, đây là khoảng thời gian thích hợp nhất cho phát triển và sản sinh cellulase. Thời gian này VSV đã thích nghi hoàn toàn với môi trường, tích tụ sản phẩm trao đổi chất, các tế bào VSV trưởng thành, sinh khối phát triển chậm và các cơ chất được cảm ứng sinh enzyme chủ yếu vào lúc này.
Sau 120 giờ nuối cấy, các nguồn C, N, P còn rất ít hoặc cạn kiệt gần hết, lượng sinh khối giảm đi do tế bào bắt đầu tự phân hủy và quá trình tích tụ sản phẩm bị chậm lại. Hơn nữa một số sản phẩm sẽ trở thành nguồn dinh dưỡng của VSV, VSV không còn duy trì khả năng sinh tổng hợp, các chất trong môi trường đã cạn, giống có thể đồng hóa trở lại các sản phẩm trao đổi chất và làm giảm hiệu suất lên men. Lúc này, sau khi VSV sử dụng hết gốc NO3- các ion kim loại còn lại (K+, Na+,…) sẽ làm kiềm hóa môi trường, làm pH môi trường tăng trở lại. Hoạt tính bắt đầu giảm dần và trở về mức ổn định, đạt 77,8UI/ml sau 168 giờ nuôi cấy.
Như vậy thời gian thích hợp cho chủng Micromonospora VTCC-A-1787 sinh tổng hợp enzyme cellulase là thời điểm 120 giờ nuôi cấy.