1.2.2.1. Cấu trúc của hệ enzyme cellulase
Cellulase là hệ enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm hòa tan. Phức hệ enzyme cellulase khá phức tạp bao gồm nhiều loại enzyme khác nhau, các enzyme này thường phối hợp hoạt động để thủy phân hoàn toàn cơ chất cellulose thành sản phẩm đơn giản nhất là glucose. Một mặt chúng như enzyme cảm ứng (mà ở đây cellulose lại là chất cảm ứng không chặt chẽ). Một mặt chúng lại chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu sự kiểm soát bởi cơ chế dị hóa.
Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase được xếp thành các nhóm khác nhau. Các nghiên cứu ban đầu chia enzyme cellulase làm hai nhóm: nhóm enzyme C1 và Cx. Trong đó, các enzyme C1 có khả năng thủy phân sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng, các enzyme Cx được chia thành hai loại: Exo-β-1,4-glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose và Endo- β-1,4-glucanase (3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết bên trong phân tử cellulose. Hiện nay theo các kết quả nghiên cứu, dựa vào đặc điểm cơ chất và cơ chế phân cắt, hệ cellulase bao gồm 3 enzyme chủ yếu sau [5, 33, 35]:
- Exo-glucanase hay C1 (EC 3.2.1.91) - Endo-β-1,4-glucanase hay Cx (EC 3.2.1.4)
- β-glucosidase hay β-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Exo-glucanase gồm 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (cello dextrinase, EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan-cellobiohydrolase (cellobio hydrolase, EC 3.2.1.74) tác dụng mạnh lên cel vô định hình hoặc cel đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên cel kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt. Exo-glucanase thủy phân các liên kết đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose (cellobiohydrolase).
Hình 1-6. Cơ chế hoạt động của Exo-glucanase
Endo-β-1,4-glucanase (hay endoglucanase, EC 3.2.1.4) thuộc nhóm thủy phân liên kết ß-1,4-glucoside, tác động bên trong phân tử cel, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác và giải phóng các sản phẩm đơn giản hơn của quá trình thủy phân này là cellulosedextrin,
cellobiose và glucose, oligosaccharide (Chellapandi et al,2008). Do thủy phân
theo kiểu ngẫu nhiên nên endo-β-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose tạo ra các chuỗi oligosaccharide có chiều dài khác nhau và tăng chậm các nhóm khử, tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cel [33, 35, 36].
Hình 1-7. Cơ chế hoạt động của Endoglucanase
ß-glucosidase (β-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21) không có khả năng phân hủy cel nguyên thủy mà tham gia thủy phân cellobiose và các cellodextrin (các β-D-glucose ở đầu tận cùng) để phóng thích các D-glucose, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase.
Hình 1-8. Cơ chế hoạt động của β-glucosidase
Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất.
Hình 1-9. Mô hình phân hủy cellulose tinh thể
1.2.2.2. Phân loại enzyme cellulase theo hội đồng danh pháp quốc tế
Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế (The International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992), enzyme cellulase thuộc:
- Nhóm 1: Thủy phân liên kết O- và S-glycoside.
- Tổ 2 (Glycosidase): Thủy phân các liên kết glycoside.
- Lớp 3 (Hydrolase): Các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân.
1.2.2.3. Cơ chế xúc tác của enzyme cellulase
Theo các tài liệu nghiên cứu thì cơ chế xúc tác của hệ enzyme celluase có nhiều kiểu tác động khác nhau. Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động hiệp đồng của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau thuỷ phân cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Tuy nhiên, hiện nay trật tự phản ứng của các enzyme vẫn chưa có sự thống nhất và có nhiều tác giả đã trình bày cơ chế tác động của cellulase theo nhiều cách khác nhau.
Năm 1950, Resse lần đầu tiên đưa ra cơ chế thủy phân cellulose hòa tan nhờ phức hệ enzyme C1 và Cx [30]. Năm 1964, các kết quả nghiên cứu khác của Resse và Mandels cho thấy C1 là nhân tố tiền phân hủy nhưng đặc hiệu, chỉ có tác dụng làm trương, tạo thành các chuỗi cel mạch ngắn, các chuỗi này lại bị tấn công bởi Cx tạo thành cellobioise, chất này bị β-glucosidase phân cắt tạo thành glucose theo sơ đồ sau:
Cellulose tự nhiên Cellulose phản ứng Đường hòa tan Glucose
Theo V.R.Snin–Ivasan (1973) cơ chế tác dụng của hệ enzyme cellulase lên cel được trình bày theo hình 1-10 sau:
Hình 1-10. Cơ chế tác dụng của hệ enzyme cellulase lên cellulose theo V.R.Snin - Ivasan (1973)
Theo hầu hết các kết quả nghiên cứu hiện nay thì để enzyme cellulase xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng thành glucose hòa tan thì cần có sự hiệp đồng của các dạng enzyme trong phức hệ cellulase. Mỗi dạng enzyme trong phức hệ celulase sẽ thủy phân phân tử có liên kết β-1,4-glucoside theo những cách khác nhau (Hình 1-11):
Cellulose có cấu trúc biến đổi
Exo-glucanase Endo-β-1,4-glucanase Oligosaccharide Các Oligosaccharide chuỗi ngắn Cellobiose Glucose
Cellulose tự nhiên (kết tinh) C1 Cx A B A, B, C A B A β - Glucosidase A: Ở nấm Trichoderma viride B: Ở vi khuẩn Cellvibrio fulvu C: Ở nhiểu vi sinh vật khác
Hình 1-11. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau:
- Trong giai đoạn thứ nhất: Endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các
liên kết 1,4-β-glucancủa sợi cellulose tinh thể để tạo thành cel biến đổi cấu trúc (đầu mạch tự do) nhưng vẫn chưa hòa tan.
- Trong giai đoạn thứ hai: Cel bị biến đổi cấu trúc sẽ tiếp tục bị thủy
phân dưới tác động của hệ enzyme. Enzyme này gồm nhiều loại khác nhau nhưng thường được chia thành 2 nhóm:
Exo-glucanase xúc tác việc tách ra một cách tuần tự cho các gốc glucose ở đầu khử và không khử của chuỗi cel và cắt từng đoạn cellobiose.
Endo-β-1,4-glucanase tiếp tục xúc tác việc phân giải liên kết β- glucoside ở bất kỳ chỗ nào bên trong phân tử cel, tạo ra các đầu mạch tự do. Kết quả tạo ra các oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và glucose. Các cellobiase sẽ thủy phân tiếp tạo thành glucose.
- Trong giai đoạn cuối cùng: Dưới tác dụng của enzyme ß-glucosidase
(EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose. Đây là enzyme rất đặc hiệu thủy phân cellobiose thành glucose mà không tấn công cel hay cellodextrin bậc cao.
Cơ chế trình bày trên cũng phù hợp với nghiên cứu Lee et al, 2002 (Hình 1-12). Ban đầu endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4-β-glucan của sợi cel để tạo thành các phân tử nhỏ hơn (sợi cellobiose). Sau đó các sợ này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải phóng ra glucose [36]. Kết quả nghiên cứu theo cơ chế này được trình bày theo hình sau:
Hình 1-12. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase.
Như vậy việc thủy phân cel hay nói đúng hơn là thủy phân các polysaccharide của thực vật không chỉ một hoặc hai enzyme là đủ mà cần tới một hệ enzyme.
1.2.2.4. Nguồn thu cellulase
Các enzyme có nhiều điểm khác nhau về đặc tính, cơ chế tác dụng và điều kiện hoạt động. Vì vậy mà tuỳ thuộc vào loại sản phẩm, các giai đoạn khác nhau của quá trình sản xuất mà người ta chọn nguồn thu nhận thích hợp. Enzyme cellulase có thể thu nhận từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau:
- Động vật: Thuộc nhóm thân mềm, lợn, gà.
- Vi sinh vật: Các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi [13, 29,34].
Trong VSV, số lượng các chủng có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên (yếm khí và hiếu khí) rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, XK, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình phân giải này. Chúng thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của nhiều yếu tố nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cel trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.
Enzyme có hoạt tính xúc tác rất cao, gấp 108÷1011 lần so với các chất xúc tác thông thường. Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì VSV được xem là nguồn cung cấp enzyme với nhiều ưu điểm nổi bật, khả năng to lớn và có tính chất độc đáo vượt xa so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Vì thế, chúng được sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme [22].
- Trước hết, hệ VSV trong tự nhiên vô cùng phong phú, là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn. Nguồn thức ăn để nuôi VSV lại dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số VSV cho enzyme thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản rẻ tiền như phế phụ liệu, phế phẩm của các ngành sản xuất.
- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16÷100 giờ). VSV sinh trưởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn, có thể tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao.
- Hơn nữa, enzyme từ VSV có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác. Do vậy chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hoá một lượng lớn cơ chất. Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối VSV làm nguồn enzyme.
- VSV rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành phần dinh dưỡng nuôi chúng cũng như một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn những chủng cho hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao, rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công
nghiệp. Điều đó cho phép ta có thể tạo được những enzyme theo ý muốn, dễ dàng thu nhận được enzyme có độ thuần khiết cao. Với VSV, người ta có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn trên các đối tượng khác để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme.
Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học, đặc biệt trong lĩnh vực sinh học nói chung và công nghệ sinh học nói riêng, cùng với nhu cầu enzyme trong các ngành công nghiệp ngày càng cao, phương pháp sinh tổng hợp enzyme ngày càng được áp dụng rộng rãi và có hiệu quả trong nhiều nước trên thế giới. Có thể nói rằng Cellulase từ VSV là một trong những enzyme có khả năng
ứng dụng rộng rãi trong tương lai.
1.2.2.5. Tính chất của enzyme cellulase
Enzyme cellulase được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau nên có tính chất khác nhau.
* Tính đặc hiệu
- Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ tác dụng lên
một cơ chất nhất định. Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-ß-D-glucosid trong phân tử cellulose và các ß-D-glucan của ngũ cốc còn exoglucanase tác động lên các đầu chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu là cellobiose, ß-glucosidase thủy phân các gốc ß-D-glucose tạo nên phân tử D-glucose [20].
* Đặc tính vật lý và hóa học
- Theo nghiên cứu, hầu hết các cellulase có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần acid amin giống nhau. Độ bền và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau. Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất ở nhiệt độ nằm trong khoảng 40÷600C, pH nằm trong khoảng 4,0÷7,0 [4, 15, 40]. Kluepfel và Ishaque (1980) đã
tuyển chọn được một chủng trong giống Streptomyces khi lên men trên môi
trường giấy lọc hoặc vi tinh thể tạo enzyme β-1,4-glucanase. Enzyme này có khả năng thủy phân Na-CMC tốt nhất ở điều kiện pH 7,0 và nhiệt độ 500C. Cellulase
của một chủng giống thuộc Thermomonosprora cũng biểu hiện thuộc tính khá
ở pH 5,9 và nhiệt độ 650C, đồng thời cũng bị ức chế bởi celobiose và glucose. Tuy vậy chủng đột biến của nó thì hoàn toàn không bị khống chế.
- Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10÷15 phút ở 800C.
* Các chất ức chế
- Enzyme Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose. Thủy ngân (Hg) ức chế hoàn toàn cellulase, trong khi các ion như Mn2+, Ag+, Cu2+ và Zn2+ chỉ ức chế nhẹ [20].