nuôi sinh enzyme
Mục tiêu của thí nghiệm là xác định nồng độ chất cảm ứng (CMC), nguồn carbon bổ sung (các nguồn đường, bã mía, mùn gỗ, rơm, cao nấm men, tinh bột gạo, tinh bột bắp, tinh bột sắn), nguồn Nitrogen vô cơ và hữu cơ (bột đậu tương, bột cá, pepton, urea, NaN03, (NH4)2SO4) vào môi trường nuôi cấy và xác định
điều kiện nuôi cấy thích hợp (nhiệt độ, pH, thời gian) để chủng Micromonospora
VTCC-A-1787 phát triển và sinh tổng hợp enzyme cellulase mạnh nhất. Enzyme thu được ở dạng C-DC được thử hoạt tính xúc tác nhằm lựa chọn môi trường nuôi cấy tối ưu. Bố trí thí nghiệm điều kiện thích hợp nuôi cấy sinh enzyme theo sơ đồ sau đây:
Ly tâm lạnh
Xác định điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ (0C)
Thời gian (giờ) Nguồn nitrogen
Chất cảm ứng CMC Nguồn carbohydrate
Dịch chiết chứa enzyme (C-DC)
Đánh giá khả năng sinh enzyme
pH
Chuẩn bị môi trường
Hấp ở 1210C/15 phút
Làm nguội
Micromonospora
VTCC-A-1787
(Tỷ lệ 10%)
Nuôi sinh enzyme
2.3.3.1. Khảo sát thời gian thích hợp sinh tổng hợp enzyme
Cấy dịch tăng sinh chủng XK Micromonospora VTCC-A-1787 ở thời
điểm sinh khối ổn định và đạt giá trị cao nhất với tỷ lệ 10% vào môi trường ISP- 4, nuôi cấy lắc 180v/phút pH 7,0 ở nhiệt độ phòng 30oC có 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Dịch enzyme được thu ở những khoảng thời gian khác nhau từ 24÷168 giờ (cách nhau 24 giờ) để xác định hoạt tính cellulase.
2.3.3.2. Xác định nồng độ cơ chất cảm ứng thích hợp
Đây là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng để quá trình phát triển và sinh tổng hợp enzyme của VSV.
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy lỏng lắc 180v/phút
trong môi trường ISP-4, pH 7,0 ở nhiệt độ phòng 30oC, có bổ sung chất cảm ứng CMC ở nồng độ khác nhau là 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 và 3%. Sau 120 giờ, thu dịch lọc, xác định hoạt tính enzyme cellulase, so sánh với mẫu không có CMC và lựa chọn nồng độ CMC thích hợp.
2.3.3.3. Xác định nguồn và nồng độ nguồn carbon thích hợp
Nguồn carbon hydrat được dùng để lên men rộng rãi nhất. Để có thể đưa vào ứng dụng trong thực tế sản xuất enzyme từ VSV sử dụng các cơ chất tự nhiên rẻ tiền, dễ kiếm. VSV không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường nhất là những VSV tổng hợp enzyme [18].
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy lỏng lắc 180v/phút
trong môi trường ISP-4 pH 7,0 ở nhiệt độ phòng 30oC và bổ sung 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Trong đó nguồn tinh bột tan được thay thế bằng nguồn carbon khác là các loại tinh bột (tinh bột gạo, tinh bột bắp, tinh bột sắn), các loại đường (glucose, fructose, sucrose, lactose, mật rỉ đường), cao nấm men, bã mía, bã rơm, mùn gỗ ở cùng nồng độ ban đầu là 1%. Dịch enzyme được thu sau 120 giờ để xác định hoạt tính.
Sau khi xác định được nguồn carbon tốt nhất, để tìm nồng độ nguồn
carbon thích hợp nhất, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi trong
1,5; 2; 2,5 và 3%. Sau 120 giờ nuôi cấy, thu dịch enyzme hoạt tính enzyme cellulase được xác định.
2.3.3.4. Xác định nguồn và nồng độ nguồn nitrogen thích hợp
Với mục tiêu là sử dụng nguyên liệu có sẵn, nguồn nitrogen vô cơ ban đầu là (NH4)2SO4 (mẫu ĐC) được thay bằng các nguồn nitrogen vô cơ là urea, NaNO3 và hữu cơ khác là bột đậu tương, bột cá, pepton với nồng độ ban đầu là
0,2%. Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy lỏng lắc 180v/phút
trong môi trường ISP-4 ở pH 7,0 tại nhiệt độ phòng 30oC, bổ sung 1,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng và nguồn carbon thích hợp là bã mía với nồng độ 2%. Dịch enzyme sau ly tâm thu được sau 120 giờ nuôi cấy mang đi xác định hoạt tính.
Sau khi xác định nguồn nitrogen tốt nhất, để chọn nồng độ nguồn nitrogen
thích hợp nhất, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi trong môi
trường có nồng độ nitrogen khác nhau: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1%. Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme được xác định.
2.3.3.5. Xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
Hoạt động trao đổi chất của VSV có thể coi là kết quả của các phản ứng hóa học. Các phản ứng hóa học lại phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ. Vì thế yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế bào. Mỗi loài VSV chỉ có thể tồn tại trong giới hạn nhiệt độ nhất định. Để nuôi cấy VSV thì việc nghiên cứu tìm ra nhiệt độ tối ưu có ý nghĩa vô cùng quan trọng.
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi trong môi trường ISP-
4 bổ sung 1,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng cùng nguồn carbon là bã mía 2% và nitrogen là bột cá 0,4%, nuôi lỏng lắc 180v/phút ở pH 7,0 bằng máy lắc ổn nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau: 25; 30; 35; 40 và 45oC. Dịch enzyme thu được ở 120 giờ được xác định hoạt tính.
2.3.3.6. Xác định pH ban đầu thích hợp của môi trường nuôi cấy
pH môi trường có ý nghĩa quyết định đến sinh trưởng và phát triển của VSV, một biến đổi nhỏ của pH cũng ảnh hưởng rất mạnh đến tế bào VSV. Thu
dịch enzyme của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy sau 120
nhiệt độ 30oC, lắc 180v/phút để xác định pH ban đầu thích hợp của môi trường nuôi cấy.
2.3.3.7. Tối ưu hóa các điều kiện nuối cấy
Nếu tối ưu hóa theo phương pháp cổ điển phải thực hiện nhiều thí nghiệm lại không xác định quan hệ tương tác giữa các yếu tố, các điều kiện nuôi cấy chỉ mới được nghiên cứu ảnh hưởng ở mức độ riêng lẻ. Do đó, chúng tôi áp dụng tối ưu hóa điệu kiện nuôi cấy của các yếu tố: nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy theo phương pháp Box Benhken.
Khi tiến hành thí nghiệm, chọn khoảng biến thiên xung quanh giá trị cực đại của đồ thị khảo sát. Hàm mục tiêu (Y) của công đoạn này thu được enzyme có chất lượng đạt yêu cầu, nghĩa là hoạt tính phải cao nhất, đồng thời hiệu suất thu dịch chiết enzyme đạt tương đối, tức Y tiến đến một giá trị cực đại trong điều kiện chấp nhận được. Căn cứ vào kết quả các thí nghiệm trên, bố trí với khoảng xác định của các yếu tố như sau:
- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp (oC): X1 - Thời gian nuôi cấy thích hợp (giờ): X2 - pH ban đầu của môi trường: X3
Mô hình tiếp cận: