2.2.1. Phương pháp hóa sinh
2.2.1.1. Đánh giá khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
Nguyên lý: Khi enzyme celullase tác dụng lên cơ chất cel trong môi
trường thạch, cơ chất bị phân hủy, độ đục của môi trường giảm và môi trường trở nên trong suốt. Độ trong suốt được tạo ra của môi trường tỷ lệ với độ hoạt động
của enzyme [19].
Kiểm tra khả năng phân giải theo phương pháp khuếch tán trên thạch, dựa vào bán kính vòng thủy phân trên thạch (D-d, mm). Sau khi nhuộm màu đỏ Công gô hoặc Lugol, vùng cơ chất bị phân giải không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch. Đo hiệu số vòng phân giải là hiệu số kích thước vòng phân giải kể cả vạch cấy và kích thước của vạch cấy [5].
Cách tiến hành: Chuẩn bị các môi trường thạch cơ chất chứa 2% agar,
0,5% cơ chất (CMC, casein, tinh bột) trong nước cất rồi phân phối vào đĩa petri dày khoảng 0,5cm. Sau khi thạch đông, khoét những giếng thạch có lỗ nhỏ đường kính 0,5cm rồi cho vào 50µl C-DC ngoại bào, giữ ở 40C trong 2h để dịch khuếch tán đều xung quanh. Ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24h, sau đó tráng dịch thuốc thử và đo đường kính phần môi trường trong suốt không bắt màu với thuốc thử. Biểu diễn hoạt tính tương đối của enzyme bằng số mm đường kính vòng thủy phân. Chủng được chọn là chủng có hoạt tính enzyme cellulase tương đối mạnh nhất (Hmax) được xác định theo công thức:
H = D - d (mm) D: Đường kính vòng ngoài d: Đường kính lỗ khoan Hình 2-5. Quá trình định tính cellulase Dịch nổi sau khi li tâm Nhỏ dịch vào lỗ khoan Đo đường kính vòng phân giải
2.2.1.2. Xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Hagedorn Jensen
Hoạt tính enzyme được xác định dựa vào định lượng đường khử theo phương pháp so màu (phương pháp Hagedorn Jensen). Một đơn vị hoạt tính của enzyme cellulase được định nghĩa là lượng enzyme có khả năng thủy phân cơ chất CMC tạo thành đường khử tương đương 1 µg glucose trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ phòng (300C) [10].
Xây dựng đường chuẩn: Dung dịch glucose chuẩn được pha có nồng độ
khác nhau từ 2,5÷12,5µg/ml. Một ml dung dịch glucose chuẩn được đo ở bước sóng 690nm [10]. Độ hấp thu và nồng độ glucose được vẽ theo chương trình Excel. Kết quả cho thấy, đường nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 2,5÷12,5µg/ml. Đường chuẩn có phương trình y = 0,0273x + 0,0082. Trong đó y là độ hấp thu (OD) ở bước sóng 690nm, x là nồng độ glucose (µg/ml), đường chuẩn được trình bày theo hình 2-6 sau:
Hình 2-6. Đường chuẩn glucose theo phương pháp so màu 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật
2.2.2.1. Phương pháp bảo quản giống
Giống xạ khuẩn đã lựa chọn được cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng YS ở nhiệt độ 30oC. Sau 3÷5 ngày khi xạ khuẩn mọc tốt, các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở 4÷6oC. Sau 2÷3 tháng cấy truyền giữ giống một lần để đảm bảo nguồn dinh dưỡng cho xạ khuẩn và đổi mới.
2.2.2.2. Đánh giá khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn
Để đánh giá tốc độ sinh trưởng của xạ khuẩn bằng cách đo sự gia tăng sinh khối, số lượng tế bào trong dịch huyền phù qua giá trị mật độ quang học OD (Optical Density) của dịch nuôi cấy trên máy so màu quang phổ ở bước sóng 620nm (A620nm) [24].
Nguyên tắc: Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình
thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới làm cho ánh sáng truyền giảm. Tế bào VSV là một thực thể nên khi hiện diện làm MT trở nên đục. Độ đục được đo bằng độ hấp phụ (OD) sử dụng máy đo quang phổ (Spectrophotometer). Giá trị OD càng cao thì độ đục càng cao, chứng tỏ sinh khối càng nhiều và VSV sinh trưởng càng mạnh. Vì vậy có thể xác định khả năng sinh trưởng của VSV thông qua đo độ đục bằng máy so màu.
Dựa vào đường chuẩn để xác định các pha sinh trưởng của VSV, từ đó tiến hành các bước giữ giống, test sinh hóa cho đúng với các giai đoạn phát triển của tế bào.
2.2.2.3. Nuôi cấy và phương pháp thu nhận, bảo quản enzyme
Chủng XK nghiên cứu sau khi hoạt hóa môi trường YS thích hợp được bổ sung với tỷ lệ 10% ISP-4 cải tiến chứa cơ chất 0,5% CMC làm nguồn cảm ứng nuôi sinh enzyme lần lượt ở các điều kiện nghiên cứu, lắc 180 vòng/phút. Sau đó, tiến hành ly tâm dịch lên men 8000v/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4oC để loại tế bào, dịch nổi được thu (phần dịch trong C-DC) mang xác định hoạt độ enzyme cellulase. Dịch nổi được thu và đem cất giữ ở nhiệt độ -20oC cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.3. Phương pháp đánh giá phân tích
- Định lượng cellulose trên nguyên tắc hòa tan bằng acid và kiềm theo TCVN 4590-88 (phụ lục 1.1).
- Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy khô ở 100÷105oC đến khối lượng không đổi theo TCVN 3700-90 (phụ lục 1.2) [27].
- Xác định hàm lượng tro toàn phần bằng phương pháp nung ở 600oCtheo TCVN 5105-90 (phụ lục 1.3) [27].
- Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh bột rong thực phẩm theo TCVN dành cho sản phẩm cần gia nhiệt trước khi sử dụng.
Các số liệu được phân tích tại Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường - trường Đại Học Nha Trang, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang
2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu chính 2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu chính
Với mục tiêu thu nhận cellulase từ XK, trước tiên tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy (nguồn cảm ứng, nguồn carbon, nguồn nitrogen) và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH và thời gian nuôi) đến sự sinh tổng hợp enzyme cellulase của 3 chủng XK lựa chọn. Tiếp đến, tiến hành đánh giá hiệu quả chiết tách enzyme bằng các loại dung môi và xác định tính chất lý hóa của C-CPE này. Sau đó ứng dụng chế phẩm enzyme kỹ thuật này để thủy phân sản xuất bột rong.
2.3.2. Bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng xạ khuẩn và môi trường thích hợp sinh tổng hợp enzyme cellulase hợp sinh tổng hợp enzyme cellulase
Không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng sinh enzyme như nhau và ngay cả những chủng cùng một giống thì khả năng sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính khác nhau. Vì vậy vấn đề quan trọng là phải lựa chọn giống ban đầu đển nuôi cấy sinh enzyme hoạt độ cao nhất.
Giống xạ khuẩn
Xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu cho giống đãchọn Tìm phương pháp thích hợp để tách và làm sạch cellulase từ môi trường nuôi cấy
Xác định một số tính chất lý hóa
Lần lượt tiến hành cấy 3 chủng Micromonospora VTCC vào 3 môi trường
nuôi cấy khác nhau Gause-I, ISP-4 và YS pH 7,0. Sau thời gian 72h tiến hành ly tâm lạnh 4oC dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu được dịch chiết chứa enzyme, xác định hoạt tính cellulase tương đối theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Kết quả lựa chọn chủng và chọn môi trường thích hợp dựa vào kích thước vòng thủy phân.
2.3.2.3. Kiểm tra các đặc điểm sinh học và đặc tính của chủng xạ khuẩn được chọn
- Quan sát đặc điểm hình thái
Dựa trên màu sắc của hệ cơ chất, được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và quan sát bề mặt bào tử để xác định hình dạng: tròn, ovan, elíp, hình que.
- Khả năng sinh enzyme ngoại bào
Bằng phương pháp khuếch tán trên thạch với một trong các nguồn cơ chất sau: Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylase), Cazein (xác định hoạt tính protease).
Ly tâm lạnh
VTCC-A-1787 VTCC-A-1762 VTCC-A-1820
Môi trường Gause I, ISP – 4, YS
Dịch chiết enzyme
Kích thước vòng thủy phân (D-d,mm)
- Chủng XK thích hợp - Môi trường sử dụng
Đặc điểm hình thái Đặc tính sinh lý, sinh hóa
Đặc điểm nuôi cấy
- Kiểm tra khả năng chịu muối
Cấy chủng xạ khuẩn lựa chọn trong môi trường thạch YS có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ từ 1÷10%, giữ trong tủ ấm 37oC. Sau 7 ngày lấy ra quan sát sự sinh trưởng, nếu chủng xạ khuẩn mọc được ta kết luận chúng có khả năng chịu muối và ngược lại [10].
- Kiểm tra khả năng lên men đường
Đối với vi sinh vật dị dưỡng như xạ khuẩn đường là nguồn carbon, là nguồn dinh dưỡng và năng lượng quan trọng để vi sinh vật thực hiện quá trình trao đổi chất xây dựng và đổi mới, ngoài ra đường còn đóng vai trò chủ chốt trong việc tạo ra năng lượng cho tế bào [10].
Môi trường lên men đường: Pepton (10g), Phenol đỏ (0,04 g), NaCl (5g),
Cao nấm men (3g), Agar (5g), Đường (10g), Nước cất 1lít, pH 7,0 ± 0,2.
Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH rồi rót 5ml vào các ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút.
- Xác định thời điểm thu sinh khối thích hợp (chu kỳ tăng trưởng)
Khảo sát sự tăng trưởng của xạ khuẩn theo thời gian dựa vào kết quả của sự tăng sinh khối. Đường cong sinh trưởng được xác định chính là sự thay đổi của độ hấp thụ quang học trong quá trình nuôi cấy.
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy liên tục trong các
môi trường lỏng YS, ISP-4, Gause-I lắc 180v/phút, pH 7,0 ở nhiệt độ phòng 300C. Cứ sau 24 giờ thu dịch nuôi cấy, tiến hành xác định số lượng tăng tế bào bằng phương pháp đo OD ở A620, từ đó xây dựng đường cong sinh trưởng và xác định quá trình kết thúc nuôi cấy thu sinh khối của xạ khuẩn.
- Xác định phương pháp nuôi cấy
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy liên tục trong các
môi trường lỏng ISP-4 pH 7,0 ở hai chế độ: tĩnh hoặc lắc 180v/phút ở nhiệt độ phòng 300C. Sau 120 giờ nuôi cấy, ly tâm thu dịch chiết chứa enzyme cellulase. Kết quả phương pháp nuôi cấy thích hợp dựa vào vòng thủy phân lớn nhất.
2.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi sinh enzyme nuôi sinh enzyme
Mục tiêu của thí nghiệm là xác định nồng độ chất cảm ứng (CMC), nguồn carbon bổ sung (các nguồn đường, bã mía, mùn gỗ, rơm, cao nấm men, tinh bột gạo, tinh bột bắp, tinh bột sắn), nguồn Nitrogen vô cơ và hữu cơ (bột đậu tương, bột cá, pepton, urea, NaN03, (NH4)2SO4) vào môi trường nuôi cấy và xác định
điều kiện nuôi cấy thích hợp (nhiệt độ, pH, thời gian) để chủng Micromonospora
VTCC-A-1787 phát triển và sinh tổng hợp enzyme cellulase mạnh nhất. Enzyme thu được ở dạng C-DC được thử hoạt tính xúc tác nhằm lựa chọn môi trường nuôi cấy tối ưu. Bố trí thí nghiệm điều kiện thích hợp nuôi cấy sinh enzyme theo sơ đồ sau đây:
Ly tâm lạnh
Xác định điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ (0C)
Thời gian (giờ) Nguồn nitrogen
Chất cảm ứng CMC Nguồn carbohydrate
Dịch chiết chứa enzyme (C-DC)
Đánh giá khả năng sinh enzyme
pH
Chuẩn bị môi trường
Hấp ở 1210C/15 phút
Làm nguội
Micromonospora
VTCC-A-1787
(Tỷ lệ 10%)
Nuôi sinh enzyme
2.3.3.1. Khảo sát thời gian thích hợp sinh tổng hợp enzyme
Cấy dịch tăng sinh chủng XK Micromonospora VTCC-A-1787 ở thời
điểm sinh khối ổn định và đạt giá trị cao nhất với tỷ lệ 10% vào môi trường ISP- 4, nuôi cấy lắc 180v/phút pH 7,0 ở nhiệt độ phòng 30oC có 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Dịch enzyme được thu ở những khoảng thời gian khác nhau từ 24÷168 giờ (cách nhau 24 giờ) để xác định hoạt tính cellulase.
2.3.3.2. Xác định nồng độ cơ chất cảm ứng thích hợp
Đây là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng để quá trình phát triển và sinh tổng hợp enzyme của VSV.
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy lỏng lắc 180v/phút
trong môi trường ISP-4, pH 7,0 ở nhiệt độ phòng 30oC, có bổ sung chất cảm ứng CMC ở nồng độ khác nhau là 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 và 3%. Sau 120 giờ, thu dịch lọc, xác định hoạt tính enzyme cellulase, so sánh với mẫu không có CMC và lựa chọn nồng độ CMC thích hợp.
2.3.3.3. Xác định nguồn và nồng độ nguồn carbon thích hợp
Nguồn carbon hydrat được dùng để lên men rộng rãi nhất. Để có thể đưa vào ứng dụng trong thực tế sản xuất enzyme từ VSV sử dụng các cơ chất tự nhiên rẻ tiền, dễ kiếm. VSV không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường nhất là những VSV tổng hợp enzyme [18].
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy lỏng lắc 180v/phút
trong môi trường ISP-4 pH 7,0 ở nhiệt độ phòng 30oC và bổ sung 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Trong đó nguồn tinh bột tan được thay thế bằng nguồn carbon khác là các loại tinh bột (tinh bột gạo, tinh bột bắp, tinh bột sắn), các loại đường (glucose, fructose, sucrose, lactose, mật rỉ đường), cao nấm men, bã mía, bã rơm, mùn gỗ ở cùng nồng độ ban đầu là 1%. Dịch enzyme được thu sau 120 giờ để xác định hoạt tính.
Sau khi xác định được nguồn carbon tốt nhất, để tìm nồng độ nguồn
carbon thích hợp nhất, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi trong
1,5; 2; 2,5 và 3%. Sau 120 giờ nuôi cấy, thu dịch enyzme hoạt tính enzyme cellulase được xác định.
2.3.3.4. Xác định nguồn và nồng độ nguồn nitrogen thích hợp
Với mục tiêu là sử dụng nguyên liệu có sẵn, nguồn nitrogen vô cơ ban đầu là (NH4)2SO4 (mẫu ĐC) được thay bằng các nguồn nitrogen vô cơ là urea, NaNO3 và hữu cơ khác là bột đậu tương, bột cá, pepton với nồng độ ban đầu là
0,2%. Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy lỏng lắc 180v/phút
trong môi trường ISP-4 ở pH 7,0 tại nhiệt độ phòng 30oC, bổ sung 1,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng và nguồn carbon thích hợp là bã mía với nồng độ 2%. Dịch enzyme sau ly tâm thu được sau 120 giờ nuôi cấy mang đi xác định hoạt tính.
Sau khi xác định nguồn nitrogen tốt nhất, để chọn nồng độ nguồn nitrogen
thích hợp nhất, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi trong môi
trường có nồng độ nitrogen khác nhau: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1%. Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme được xác định.
2.3.3.5. Xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
Hoạt động trao đổi chất của VSV có thể coi là kết quả của các phản ứng hóa học. Các phản ứng hóa học lại phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ. Vì thế yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế bào. Mỗi loài VSV chỉ có thể tồn tại trong giới hạn nhiệt độ nhất định. Để nuôi cấy VSV thì việc nghiên cứu tìm ra nhiệt độ tối ưu có ý nghĩa vô cùng quan trọng.
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi trong môi trường ISP-
4 bổ sung 1,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng cùng nguồn carbon là bã mía 2% và nitrogen là bột cá 0,4%, nuôi lỏng lắc 180v/phút ở pH 7,0 bằng máy lắc ổn nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau: 25; 30; 35; 40 và 45oC. Dịch enzyme thu được ở 120 giờ được xác định hoạt tính.
2.3.3.6. Xác định pH ban đầu thích hợp của môi trường nuôi cấy
pH môi trường có ý nghĩa quyết định đến sinh trưởng và phát triển của VSV, một biến đổi nhỏ của pH cũng ảnh hưởng rất mạnh đến tế bào VSV. Thu
dịch enzyme của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy sau 120
nhiệt độ 30oC, lắc 180v/phút để xác định pH ban đầu thích hợp của môi trường nuôi cấy.
2.3.3.7. Tối ưu hóa các điều kiện nuối cấy
Nếu tối ưu hóa theo phương pháp cổ điển phải thực hiện nhiều thí nghiệm lại không xác định quan hệ tương tác giữa các yếu tố, các điều kiện nuôi cấy chỉ mới được nghiên cứu ảnh hưởng ở mức độ riêng lẻ. Do đó, chúng tôi áp dụng tối ưu hóa điệu kiện nuôi cấy của các yếu tố: nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy theo phương pháp Box Benhken.
Khi tiến hành thí nghiệm, chọn khoảng biến thiên xung quanh giá trị cực đại của đồ thị khảo sát. Hàm mục tiêu (Y) của công đoạn này thu được enzyme