Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp cellulase theo thời gian, chủng
Micromonospora VTCC-A-1787 được hoạt hóa trong môi trường ISP-4 ở 30oC, lắc 180v/phút, pH 7,0. Sau 3 ngày bổ sung giống với tỷ lệ 10% vào môi trường có 0,5% CMC. Dịch enzyme được thu ở các khoảng thời gian khác nhau từ 24÷168h để xác định hoạt tính tương đối. Kết quả cho thấy, trên đĩa thạch xuất hiện các vòng phân giải cơ chất CMC với đường kính khác nhau (hình 3-5), đồng thời khả năng
sinh tổng hợp cellulluase từ chủng Micromonospora VTCC-A-1787 trên môi
trường ISP-4 cũng được định lượng và định tính (bảng 2, phụ lục 2 và hình 3-6).
Trong điều kiện nuôi cấy, toàn bộ quá trình sinh trưởng của VSV gắn liền với sự thay đổi theo thời gian. Trong môi trường, các chất dinh dưỡng theo thời gian sẽ giảm, và tương ứng số lượng tế bào VSV sẽ tăng lên, đồng thời hoạt tính trao đổi chất của tế bào cũng thay đổi. Đối với enzyme là loại sản phẩm mà sự hình thành của nó gắn liền với sự sinh trưởng của VSV, sự tổng hợp này xảy ra trong thời gian sinh trưởng và còn có thể tiếp diễn sau khi pha sinh trưởng đã kết thúc.
Hình 3-7. Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo thời gian của chủng
Micromonospora VTCC-A-1787
Sau 24 giờ nuôi cấy, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có khả năng
sinh cellulase với hoạt tính thấp nhất đạt 54,9UI/ml, H = 4mm. Mối liên hệ giữa thời gian nuôi cấy với hoạt tính cellulase không cao là do ở thời gian này XK chưa kịp thích ứng với môi trường mới, số lượng tế bào phát triển chưa nhiều, các sản phẩm trao đổi chất của VSV nuôi cấy ở thời gian kỳ này không có hoặc bắt đầu tích tụ với một số lượng nhỏ, pH của môi trường ban đầu ít thay đổi. Sau 72h, hoạt tính enzyme đạt 89,2UI/ml với H, 15mm do lúc này XK đã dần thích ứng với môi trường mới và bắt đầu phát triển mạnh, nhu cầu nguồn cơ chất tăng cao, XK phải tiết enzyme để phân hủy các chất phức tạp để làm nguồn dinh dưỡng, lượng enzyme tiết ra dần dần tăng lên đồng thời với sự phát triển của chủng VSV đến khi ổn định, thời điểm này pH bắt đầu giảm mạnh do các sản phẩm trao đổi chất như acid hữu cơ, các loại rượu làm thay đổi pH. Hoạt tính enzyme đạt tối đa ở 120 giờ là 129,1UI/ml với H, 18mm, đây là khoảng thời gian thích hợp nhất cho phát triển và sản sinh cellulase. Thời gian này VSV đã thích nghi hoàn toàn với môi trường, tích tụ sản phẩm trao đổi chất, các tế bào VSV trưởng thành, sinh khối phát triển chậm và các cơ chất được cảm ứng sinh enzyme chủ yếu vào lúc này.
Sau 120 giờ nuối cấy, các nguồn C, N, P còn rất ít hoặc cạn kiệt gần hết, lượng sinh khối giảm đi do tế bào bắt đầu tự phân hủy và quá trình tích tụ sản phẩm bị chậm lại. Hơn nữa một số sản phẩm sẽ trở thành nguồn dinh dưỡng của VSV, VSV không còn duy trì khả năng sinh tổng hợp, các chất trong môi trường đã cạn, giống có thể đồng hóa trở lại các sản phẩm trao đổi chất và làm giảm hiệu suất lên men. Lúc này, sau khi VSV sử dụng hết gốc NO3- các ion kim loại còn lại (K+, Na+,…) sẽ làm kiềm hóa môi trường, làm pH môi trường tăng trở lại. Hoạt tính bắt đầu giảm dần và trở về mức ổn định, đạt 77,8UI/ml sau 168 giờ nuôi cấy.
Như vậy thời gian thích hợp cho chủng Micromonospora VTCC-A-1787 sinh tổng hợp enzyme cellulase là thời điểm 120 giờ nuôi cấy.