2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu chính
Với mục tiêu thu nhận cellulase từ XK, trước tiên tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy (nguồn cảm ứng, nguồn carbon, nguồn nitrogen) và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH và thời gian nuôi) đến sự sinh tổng hợp enzyme cellulase của 3 chủng XK lựa chọn. Tiếp đến, tiến hành đánh giá hiệu quả chiết tách enzyme bằng các loại dung môi và xác định tính chất lý hóa của C-CPE này. Sau đó ứng dụng chế phẩm enzyme kỹ thuật này để thủy phân sản xuất bột rong.
2.3.2. Bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng xạ khuẩn và môi trường thích hợp sinh tổng hợp enzyme cellulase hợp sinh tổng hợp enzyme cellulase
Không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng sinh enzyme như nhau và ngay cả những chủng cùng một giống thì khả năng sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính khác nhau. Vì vậy vấn đề quan trọng là phải lựa chọn giống ban đầu đển nuôi cấy sinh enzyme hoạt độ cao nhất.
Giống xạ khuẩn
Xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu cho giống đãchọn Tìm phương pháp thích hợp để tách và làm sạch cellulase từ môi trường nuôi cấy
Xác định một số tính chất lý hóa
Lần lượt tiến hành cấy 3 chủng Micromonospora VTCC vào 3 môi trường
nuôi cấy khác nhau Gause-I, ISP-4 và YS pH 7,0. Sau thời gian 72h tiến hành ly tâm lạnh 4oC dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu được dịch chiết chứa enzyme, xác định hoạt tính cellulase tương đối theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Kết quả lựa chọn chủng và chọn môi trường thích hợp dựa vào kích thước vòng thủy phân.
2.3.2.3. Kiểm tra các đặc điểm sinh học và đặc tính của chủng xạ khuẩn được chọn
- Quan sát đặc điểm hình thái
Dựa trên màu sắc của hệ cơ chất, được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và quan sát bề mặt bào tử để xác định hình dạng: tròn, ovan, elíp, hình que.
- Khả năng sinh enzyme ngoại bào
Bằng phương pháp khuếch tán trên thạch với một trong các nguồn cơ chất sau: Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylase), Cazein (xác định hoạt tính protease).
Ly tâm lạnh
VTCC-A-1787 VTCC-A-1762 VTCC-A-1820
Môi trường Gause I, ISP – 4, YS
Dịch chiết enzyme
Kích thước vòng thủy phân (D-d,mm)
- Chủng XK thích hợp - Môi trường sử dụng
Đặc điểm hình thái Đặc tính sinh lý, sinh hóa
Đặc điểm nuôi cấy
- Kiểm tra khả năng chịu muối
Cấy chủng xạ khuẩn lựa chọn trong môi trường thạch YS có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ từ 1÷10%, giữ trong tủ ấm 37oC. Sau 7 ngày lấy ra quan sát sự sinh trưởng, nếu chủng xạ khuẩn mọc được ta kết luận chúng có khả năng chịu muối và ngược lại [10].
- Kiểm tra khả năng lên men đường
Đối với vi sinh vật dị dưỡng như xạ khuẩn đường là nguồn carbon, là nguồn dinh dưỡng và năng lượng quan trọng để vi sinh vật thực hiện quá trình trao đổi chất xây dựng và đổi mới, ngoài ra đường còn đóng vai trò chủ chốt trong việc tạo ra năng lượng cho tế bào [10].
Môi trường lên men đường: Pepton (10g), Phenol đỏ (0,04 g), NaCl (5g),
Cao nấm men (3g), Agar (5g), Đường (10g), Nước cất 1lít, pH 7,0 ± 0,2.
Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH rồi rót 5ml vào các ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút.
- Xác định thời điểm thu sinh khối thích hợp (chu kỳ tăng trưởng)
Khảo sát sự tăng trưởng của xạ khuẩn theo thời gian dựa vào kết quả của sự tăng sinh khối. Đường cong sinh trưởng được xác định chính là sự thay đổi của độ hấp thụ quang học trong quá trình nuôi cấy.
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy liên tục trong các
môi trường lỏng YS, ISP-4, Gause-I lắc 180v/phút, pH 7,0 ở nhiệt độ phòng 300C. Cứ sau 24 giờ thu dịch nuôi cấy, tiến hành xác định số lượng tăng tế bào bằng phương pháp đo OD ở A620, từ đó xây dựng đường cong sinh trưởng và xác định quá trình kết thúc nuôi cấy thu sinh khối của xạ khuẩn.
- Xác định phương pháp nuôi cấy
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy liên tục trong các
môi trường lỏng ISP-4 pH 7,0 ở hai chế độ: tĩnh hoặc lắc 180v/phút ở nhiệt độ phòng 300C. Sau 120 giờ nuôi cấy, ly tâm thu dịch chiết chứa enzyme cellulase. Kết quả phương pháp nuôi cấy thích hợp dựa vào vòng thủy phân lớn nhất.
2.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi sinh enzyme nuôi sinh enzyme
Mục tiêu của thí nghiệm là xác định nồng độ chất cảm ứng (CMC), nguồn carbon bổ sung (các nguồn đường, bã mía, mùn gỗ, rơm, cao nấm men, tinh bột gạo, tinh bột bắp, tinh bột sắn), nguồn Nitrogen vô cơ và hữu cơ (bột đậu tương, bột cá, pepton, urea, NaN03, (NH4)2SO4) vào môi trường nuôi cấy và xác định
điều kiện nuôi cấy thích hợp (nhiệt độ, pH, thời gian) để chủng Micromonospora
VTCC-A-1787 phát triển và sinh tổng hợp enzyme cellulase mạnh nhất. Enzyme thu được ở dạng C-DC được thử hoạt tính xúc tác nhằm lựa chọn môi trường nuôi cấy tối ưu. Bố trí thí nghiệm điều kiện thích hợp nuôi cấy sinh enzyme theo sơ đồ sau đây:
Ly tâm lạnh
Xác định điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ (0C)
Thời gian (giờ) Nguồn nitrogen
Chất cảm ứng CMC Nguồn carbohydrate
Dịch chiết chứa enzyme (C-DC)
Đánh giá khả năng sinh enzyme
pH
Chuẩn bị môi trường
Hấp ở 1210C/15 phút
Làm nguội
Micromonospora
VTCC-A-1787
(Tỷ lệ 10%)
Nuôi sinh enzyme
2.3.3.1. Khảo sát thời gian thích hợp sinh tổng hợp enzyme
Cấy dịch tăng sinh chủng XK Micromonospora VTCC-A-1787 ở thời
điểm sinh khối ổn định và đạt giá trị cao nhất với tỷ lệ 10% vào môi trường ISP- 4, nuôi cấy lắc 180v/phút pH 7,0 ở nhiệt độ phòng 30oC có 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Dịch enzyme được thu ở những khoảng thời gian khác nhau từ 24÷168 giờ (cách nhau 24 giờ) để xác định hoạt tính cellulase.
2.3.3.2. Xác định nồng độ cơ chất cảm ứng thích hợp
Đây là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng để quá trình phát triển và sinh tổng hợp enzyme của VSV.
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy lỏng lắc 180v/phút
trong môi trường ISP-4, pH 7,0 ở nhiệt độ phòng 30oC, có bổ sung chất cảm ứng CMC ở nồng độ khác nhau là 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 và 3%. Sau 120 giờ, thu dịch lọc, xác định hoạt tính enzyme cellulase, so sánh với mẫu không có CMC và lựa chọn nồng độ CMC thích hợp.
2.3.3.3. Xác định nguồn và nồng độ nguồn carbon thích hợp
Nguồn carbon hydrat được dùng để lên men rộng rãi nhất. Để có thể đưa vào ứng dụng trong thực tế sản xuất enzyme từ VSV sử dụng các cơ chất tự nhiên rẻ tiền, dễ kiếm. VSV không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường nhất là những VSV tổng hợp enzyme [18].
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy lỏng lắc 180v/phút
trong môi trường ISP-4 pH 7,0 ở nhiệt độ phòng 30oC và bổ sung 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Trong đó nguồn tinh bột tan được thay thế bằng nguồn carbon khác là các loại tinh bột (tinh bột gạo, tinh bột bắp, tinh bột sắn), các loại đường (glucose, fructose, sucrose, lactose, mật rỉ đường), cao nấm men, bã mía, bã rơm, mùn gỗ ở cùng nồng độ ban đầu là 1%. Dịch enzyme được thu sau 120 giờ để xác định hoạt tính.
Sau khi xác định được nguồn carbon tốt nhất, để tìm nồng độ nguồn
carbon thích hợp nhất, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi trong
1,5; 2; 2,5 và 3%. Sau 120 giờ nuôi cấy, thu dịch enyzme hoạt tính enzyme cellulase được xác định.
2.3.3.4. Xác định nguồn và nồng độ nguồn nitrogen thích hợp
Với mục tiêu là sử dụng nguyên liệu có sẵn, nguồn nitrogen vô cơ ban đầu là (NH4)2SO4 (mẫu ĐC) được thay bằng các nguồn nitrogen vô cơ là urea, NaNO3 và hữu cơ khác là bột đậu tương, bột cá, pepton với nồng độ ban đầu là
0,2%. Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy lỏng lắc 180v/phút
trong môi trường ISP-4 ở pH 7,0 tại nhiệt độ phòng 30oC, bổ sung 1,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng và nguồn carbon thích hợp là bã mía với nồng độ 2%. Dịch enzyme sau ly tâm thu được sau 120 giờ nuôi cấy mang đi xác định hoạt tính.
Sau khi xác định nguồn nitrogen tốt nhất, để chọn nồng độ nguồn nitrogen
thích hợp nhất, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi trong môi
trường có nồng độ nitrogen khác nhau: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1%. Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme được xác định.
2.3.3.5. Xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
Hoạt động trao đổi chất của VSV có thể coi là kết quả của các phản ứng hóa học. Các phản ứng hóa học lại phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ. Vì thế yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế bào. Mỗi loài VSV chỉ có thể tồn tại trong giới hạn nhiệt độ nhất định. Để nuôi cấy VSV thì việc nghiên cứu tìm ra nhiệt độ tối ưu có ý nghĩa vô cùng quan trọng.
Chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi trong môi trường ISP-
4 bổ sung 1,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng cùng nguồn carbon là bã mía 2% và nitrogen là bột cá 0,4%, nuôi lỏng lắc 180v/phút ở pH 7,0 bằng máy lắc ổn nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau: 25; 30; 35; 40 và 45oC. Dịch enzyme thu được ở 120 giờ được xác định hoạt tính.
2.3.3.6. Xác định pH ban đầu thích hợp của môi trường nuôi cấy
pH môi trường có ý nghĩa quyết định đến sinh trưởng và phát triển của VSV, một biến đổi nhỏ của pH cũng ảnh hưởng rất mạnh đến tế bào VSV. Thu
dịch enzyme của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được nuôi cấy sau 120
nhiệt độ 30oC, lắc 180v/phút để xác định pH ban đầu thích hợp của môi trường nuôi cấy.
2.3.3.7. Tối ưu hóa các điều kiện nuối cấy
Nếu tối ưu hóa theo phương pháp cổ điển phải thực hiện nhiều thí nghiệm lại không xác định quan hệ tương tác giữa các yếu tố, các điều kiện nuôi cấy chỉ mới được nghiên cứu ảnh hưởng ở mức độ riêng lẻ. Do đó, chúng tôi áp dụng tối ưu hóa điệu kiện nuôi cấy của các yếu tố: nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy theo phương pháp Box Benhken.
Khi tiến hành thí nghiệm, chọn khoảng biến thiên xung quanh giá trị cực đại của đồ thị khảo sát. Hàm mục tiêu (Y) của công đoạn này thu được enzyme có chất lượng đạt yêu cầu, nghĩa là hoạt tính phải cao nhất, đồng thời hiệu suất thu dịch chiết enzyme đạt tương đối, tức Y tiến đến một giá trị cực đại trong điều kiện chấp nhận được. Căn cứ vào kết quả các thí nghiệm trên, bố trí với khoảng xác định của các yếu tố như sau:
- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp (oC): X1 - Thời gian nuôi cấy thích hợp (giờ): X2 - pH ban đầu của môi trường: X3
Mô hình tiếp cận:
2.4.. Bố trí thí nghiệm thu nhận C-CPE từ dịch nuôi cấy 2.4.1. Lựa chọn tác nhân kết tủa 2.4.1. Lựa chọn tác nhân kết tủa
C-DC được kết tủa bằng các dung môi Ethanol 960, Aceton 99,5% và dung dịch (NH4)2SO4. Cố định kết tủa ở nồng độ 70%, nhiệt độ lạnh là 40C và thời gian kết tủa là 30 phút. Sau khi kết tủa, đem ly tâm 12000v/phút ở nhiệt độ 40C trong 15 phút, loại bỏ dịch trong, thu được kết tủa nhão, đó là C-CPE. Cân lượng kết tủa nhão và xác định hoạt tính enzyme cellulase.
Quá trình nuôi cấy Hoạt độ Cellulase (UI/ml) Nhiệt độ thủy phân (X1)
Thời gian thủy phân (X2) pH (X3)
2.4.2. Lựa chọn nồng độ kết tủa
Sau khi chọn được tác nhân gây kết tủa, tiến hành chọn chế độ kết tủa lần lượt ở nồng độ khác nhau: 40; 50; 60; 70 và 80% trong thời gian 30 phút. Tiêu chuẩn để so sánh hiệu quả và lựa chọn phương pháp chiết tách enzyme thích hợp là khối lượng C-CPE thu được từ một lượng dịch chiết nhất định và hoạt tính cellulase của C-CPE phải cao nhất (so với hoạt độ của dịch chiết chứa cellulase).
2.4.3. Xác định tính chất lý hóa của C-CPE
Mỗi enzyme hoạt động ở một ngưỡng nhiệt độ và pH nhất định. Vì vậy xác định các điều kiện thích hợp cho hoạt tính của enzyme có ý nghĩa ứng dụng thực tiễn rất quan trọng.
Dịch nuôi cấy
Aceton 99,5%
Kết tủa lạnh ở nồng độ 70%
Ethanol 960 Ammonium suphate
C-CPE
Hoạt độ cellulase (UI/g)
- Chọn chất kết tủa TH
- Chọn nồng độ kết tủaTH Ly tâm lạnh
2.4.3.1. Xác định nhiệt độ phản ứng thích hợp
Hỗn hợp phản ứng của dịch C-CPE cellulase với dung dịch cơ chất 0,7% CMC (w/v) điều chỉnh bằng đệm natri acetate pH 5,5 được ủ ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng 30÷550C để tìm nhiệt độ phản ứng thích hợp.
2.4.3.2. Xác định pH phản ứng thích hợp
Để xác định pH thích hợp cho phản ứng xúc tác của enzyme, C-CPE cellulase được ủ với dung dịch cơ chất 0,7% CMC (w/v) điều chỉnh trong đệm natri acetate và potassium phosphate có pH từ 5,0÷7,0 hỗn hợp phản ứng được ủ ở 450C.
2.5. Thử nghiệm sản xuất bột rong thủy phân từ rong Mứt Porphyra vietnamensis
Sau khi xác định các tính chất lý hóa của C-CPE, tiến hành sản xuất bột rong thủy phân hòa tan theo các điều kiện đã lựa chọn và phân tích sơ bộ các thành phần hóa học của bột rong sản xuất được. Tham khảo một số quy trình sản xuất [21], dựa vào đặc điểm của sản phẩm và tính chất của nguyên liệu, luận văn đề xuất quy trình sản xuất bột rong thực phẩm theo sơ đồ sau:
C-CPE cellulase
Điều kiện pH, nhiệt độ
Hoạt độ cellulase (UI/g)
- Chọn pHopt - Chọn topt
C-CPE
Micromonospora
VTCC-A-1787
Rong Mứt tươi Ngâm rửa
Tẩy mùi Phơi nắng Rửa Sấy khô Nghiền nhỏ Thủy phân Nâng nhiệt Lắng và lọc Bột nhão
Đánh giá cảm quan Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật Xác định thành phần hóa học Sấy khô Bột rong Dịch trong
Thuyết minh quy trình
- Rong nguyên liệu: Rong được thu hái thủ công, rong ít tạp chất, cát sạn, có lẫn ốc nhỏ.
Hình 2.7. Mẫu rong mứt tươi Porphyra vietnamensis
- Ngâm rửa: Quá trình ngâm nước giúp loại bỏ các tạp chất lẫn trong rong như: cát, ốc, sò bám trên rong. Đồng thời làm cho một số chất màu, chất mùi, nước biển khuếch tán vào nước giúp hạn chế vi sinh vật phá hủy rong và nâng cao chất lượng bột rong. Rửa rong tươi 3 lần, có khuấy đảo, ở nhiệt độ phòng 300C, tỷ lệ nước rửa/rong tươi là 5/1 (v/w), thời gian là 15 phút/lần.
- Phơi nắng: Tia tử ngoại của ánh sáng mặt trời có khả năng tẩy trắng và làm khử mùi tanh của rong, giúp giảm ẩm độ nhằm tăng thời gian bảo quản. Rong khô phải được bảo quản trong bì hoặc túi nylông kín để tránh hút ẩm vì trên rong có rất nhiều muối. Để rong nơi khô ráo thoáng mát, thỉnh thoảng phải mang rong phơi lại. Phơi rong trong thời gian khoảng 24÷36 tiếng, nhiệt độ từ 30÷350C. Sau khi phơi tỷ lệ rong tươi/rong khô là 4/1, độ ẩm đạt ≤ 22%.
- Tẩy mùi: Rong Mứt có mùi tanh đặc trưng của thực vật thủy sinh, mùi tanh này rất khó chịu làm giảm giá trị cảm quan của thành phẩm sau này. Công đoạn này nhằm khử bớt mùi của rong, đồng thời làm mềm và bào mòn màng cellulose của cây rong, tạo điều kiện cho quá trình thủy phân nhanh và giảm bớt lượng tạp chất của phần cellulose. Acid cũng có tác dụng tăng cường oxy hóa và làm vỡ lớp ngoại bì chứa nhiều sắc tố, loại sắc tố ra khỏi cây rong và hòa tan chất