hợp enzyme cellulase
VSV cũng giống như các sinh vật khác chịu ảnh hưởng bởi tác động của môi trường, do cấu tạo đơn giản nên chúng rất mẫn cảm đối với những thay đổi dù nhỏ nhất của môi trường xung quanh. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, tế bào VSV tiến hành trao đổi không ngừng với môi trường xung quanh. Tế bào VSV tuy rất nhỏ nhưng vì hấp thụ các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm trao đổi qua toàn bộ bề mặt cho nên cường độ trao đổi chất rất lớn. Các chất dinh dưỡng vào tế bào qua màng và được chuyển hóa tạo thành những chất riêng biệt cần thiết cho quá trình xây dựng tế bào. Nhờ quá trình đồng hóa các tế bào mới có thể sinh trưởng phát triển và không ngừng tăng sinh khối, đồng thời sản sinh ra các sản phẩm trao đổi chất.
Riêng với XK là loài sinh vật sống dị dưỡng phân giải nguồn cơ chất trong môi trường nơi chúng sống dựa vào hệ enzyme ngoại bào do chúng tiết ra để sinh trưởng và phát triển. Tốc độ và số lượng enzyme tiết ra phụ thuộc rất nhiều vào các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, nguồn carbon và nguồn nitrogen. Do vậy, tùy theo mục đích nghiên cứu, tùy chủng loại vi sinh vật mà chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp, hoặc tạo cho môi trường có thành phần dinh dưỡng để chúng phát triển cực đại và thu được nhiều sản phẩm nhất.
1.2.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
a. Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường
Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bào, sự sinh sản và sự trao đổi chất của VSV. VSV có thể phát triển ở tất cả các vùng nhiệt độ khác nhau, mỗi loài VSV thích nghi với một vùng nhiệt độ khác nhau. Phần lớn VSV chịu tác động của nhiệt độ trong khoảng từ -10 đến +900C. Trong phạm vi này, nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng, nhu cầu dinh dưỡng, cả đến thành phần enzyme và thành phần hóa học của tế bào (Bảng 1.2: Kiều Hữu Ánh & Ngô Tự Thành, 1985). Theo Nguyễn Đức Lượng & Nguyễn Thị Thùy Dương (2003), khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của VSV, các nhà khoa học chia chúng ra thành các nhóm khác nhau. Tuy nhiên, sự phân chia các nhóm VSV quan hệ với nhiệt độ chỉ có tính chất tương đối, các nhóm này không tách biệt nhau rõ ràng mà gắn liền với nhau qua các dạng trung gian. Bảng 1.2. Phân nhóm VSV theo khả năng phát triển ở nhiệt độ khác nhau
STT Nhóm vsv
Nhiệt độ cực tiểu (oC)
Nhiệt độ tối ưu (oC) Nhiệt độ cực đại (oC) 1 2 3 Ưa lạnh Ưa ấm Ưa nóng -10 đến +5 +10 đến +15 +25 đến +45 +10 đến +20 +30 đến +40 +50 đến +65 +20 đến +30 +40 đến +50 +75 đến +90
Nghiên cứu của Vũ Thị Thanh Bình trên đối tượng Streptomyces Thermovulagaris B6 cho thấy nhiệt độ tối thích cho nuôi cấy là 55oC. Ở nhiệt độ này, Cellulase cho hoạt tính cao nhất với đường kính vòng thủy phân 3,2cm [3].
b. Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy ban đầu
pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đối với sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp enzyme của VSV. Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có tác động mạnh mẽ. Mỗi loài vi sinh vật có pH nuôi cấy khác nhau phù hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme. pH thích hợp cho mỗi loài có thể là acid, trung tính hay
kiềm. Việc xác định pH môi trường ban đầu thích hợp và duy trì pH ổn định trong suốt quá trình sinh trưởng của tế bào rất quan trọng.
c. Độ thông khí
XK là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các VSV khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống. Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, người ta thường bổ sung vào môi trường lên men benzilthioxyanat hay nuôi cấy ở chế độ lắc làm tăng khả năng oxy hòa tan.
d. Tuổi giống và lượng giống
Việc tổng hợp enzyme không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men, mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng. Tùy vào mục đích mà bổ sung tuổi giống và lượng giống cho phù hợp. Lượng giống được cấy truyền vào ban đầu khoảng từ 2÷10% với tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất enzyme cao nhất thường sau 24 giờ tuổi, với XK là loài sinh trưởng và phát triển chậm thời gian có thể lâu hơn [8].
Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các loại enzyme của các VSV còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác như: thời gian nuôi cấy, tốc độ khuấy đảo và sục khí, các thành phần của môi trường nuôi cấy, phương pháp nuôi cấy.
1.2.3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men
a. Ảnh hưởng nguồn carbon
Carbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong các phân tử enzyme, acid nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy những hợp chất chứa carbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sống của VSV. Tùy đặc điểm sinh lý của từng loài VSV mà nguồn carbon được sử dụng để sinh enzyme cellulase là khác nhau, có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loại thích hợp với nhiều nguồn carbon. Hầu như không có hợp chất carbon nào mà không bị nhóm VSV này hoặc nhóm VSV khác phân giải [22].
Do cellulase là enzyme cảm ứng, đòi hỏi cơ chất là cel nên chúng có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp cellulase. Nguồn cung cấp carbon có thể là các loại carbonhydrat đơn giản như đường đơn, đường đôi, hoặc phức tạp hơn
như tinh bột, cel. Nguồn carbon phức tạp này thường tồn tại ở hầu hết các sản phẩm thô, ít tinh khiết như các phế phẩm trấu cám, bã mía, lõi ngô, mạt cưa, giấy lọc, bã củ cải đường. Nhiều chất hữu cơ này vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, VSV phải tiết ra enzyme cellulase để thủy phân, chuyển hóa chúng thành các hợp chất dễ hấp thụ (đường, amino acid, acid béo). Một số công trình nghiên cứu đã cho thấy cellulase là một enzyme cảm ứng thì với một số nguồn carbon như glucose, sacarose, axetat, succinat lại chính là tác nhân ức chế quá trình tổng hợp enzyme này.
Theo Stutzenberger và cộng sự (1971) cho biết trong các VSV phân giải cel được phân lập từ phân rác ủ thì chiếm ưu thế là loài XK ưa nhiệt
Thermonospora curvata phát triển nhanh chóng ở nhiệt độ 50÷60oC và tích lũy khá nhiều enzyme phân giải cel trên môi trường nuôi cấy chứa cel vi tinh thể và cao nấm men. Nếu bổ sung vào môi trường có bông nghiền nhỏ có khả năng làm tăng việc tích lũy enzyme C1 và Cx .
Theo Toyama (1975) thì với cơ chất là cám gạo, thành phần kích thích sinh tổng hợp cellulase không phải là phần bột mịn giàu chất dinh dưỡng mà là phần thô giàu chất xơ.
Theo nghiên cứu của Vũ Thị Thanh Bình và Nguyễn Thành Đạt (1991) cũng đã phân lập được hàng trăm chủng XK ưa nhiệt và đã chọn được chủng
Streptomyce Thermovulgaris B6 có khả năng sinh cellulase trên các nguồn carbon
như cel vi tinh thể Na-CMC, bông và giấy lọc [3]. Các nghiên cứu trên các nguồn cơ chất riêng lẻ là cám gạo, vỏ lạc, lõi ngô và rơm đều tạo cellulase với hoạt tính khác nhau. Nhưng khi phối trộn giữa các nguồn carbon theo tỷ lệ thích hợp thì hoạt tính cellulase thu được cao hơn thể hiện ở độ giảm trọng lượng cel qua quá trình nuôi cấy.
Qua nghiên cứu, các tác giả đều nhận thấy các nguồn carbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzyme cellulase. Theo thời gian, nguồn carbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổng hợp enzyme cellulase cũng thay đổi. Thời gian đầu, các tác
giả chủ yếu sử dụng các nguồn carbon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn carbon vào môi trường nuôi cấy. Nhưng gần đây các nghiên cứu hướng đến kết hợp bổ sung nhiều nguồn carbon tinh khiết vào cùng môi trường nuôi cấy và hướng tới sử dụng các phế phụ liệu, các chất thải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzyme cellulase.
b. Ảnh hưởng nguồn Nitrogen
VSV cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ để tạo thành các nhóm amin (-NH2) và các nhóm imin (=NH) trong quá trình sống, xây dựng tế bào, vì tất cả các thành phần quan trọng của tế bào đều chứa nitơ (protein, acid nucleotic, enzyme…). Trong tất cả môi trường nuôi cấy cần thiết phải có các loại hợp chất nitơ mà vi sinh vật có thể đồng hóa được. Việc chọn nguồn nitơ là rất cần thiết để đảm bảo được hiệu suất sinh tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế trong sản xuất vi sinh vật [22]. Tốc độ tiết enzyme của các loài VSV không những phụ thuộc vào nguồn N mà còn phụ thuộc vào tỷ số C/N trong môi trường. Tỷ số này rất có ý nghĩa, nó tạo cho VSV có khả năng trao đổi chất thích hợp, khả năng tích tụ cao các sản phẩm sinh tổng hợp và tạo thành các enzyme để tiến hành các phản ứng sinh hóa theo hướng có lợi [22]. Tùy loại VSV mà sử dụng nguồn nitrogen khác nhau. Có nhiều hợp chất Nitơ ứng dụng vào sản xuất nhưng có những loại cho hiệu suất lên men cao nhất. Nguồn Nitơ dễ hấp thụ đối với VSV là NO3
- và NH4
+
. Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với XK: NH4OH, (NH4)2HPO4, (NH4)3PO4, (NH4)2CO3, NH4NO3 hay khí NH3; các hợp chất amon: Citrat amonium, Acetat amonium, Tactrat amonium, Oxalat ammonium và ở các dạng hợp chất hữu cơ cao phân tử như cao thịt, bột đậu tương, bột cá, pepton. Đa số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa từng loại nitrogen để sinh enzyme lại phụ thuộc vào từng loài. Tất cả các loại vsv đều có thể đồng hóa được muối amon. Việc sử dụng nguồn hữu cơ, urê, muối amon đều gắn liền với việc tách NH3 ra rồi hấp thụ vào tế bào. Như vậy NH3 là trung tâm của các con đường dinh dưỡng Nitrogen của vsv. Trong công nghiệp người ta thường dùng NH3 dưới dạng nước, khí hoặc urê. Khi dùng urê cần quan tâm tới nồng độ ban đầu vì khả năng chịu đựng urê của mỗi giống mỗi khác.
Nghiên cứu của Vũ Thị Thanh Bình trên đối tượng Streptomyces Thermovulagaris B6 khi nuôi cấy trên tỷ lệ cám gạo:vỏ lạc theo tỷ lệ 1:1 ở các trị
số khác nhau, sau 4 ngày nuôi cấy ở pH 7,0 chủng này sản sinh Cellulase có hoạt tính mạnh nhất, thấp hơn là ở các pH 8, 9, 6 và thấp nhất là ở pH 5,0. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hensen (1957) trên loài
Streptomyces Thermovulagaris [3].
c. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng khoáng
Phosphorus (P) đóng vai trò quan trọng trong sự trao đổi chất và năng lượng trong tế bào VSV, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật, có mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế bào (acid nucleic, phosphoprotein, ADP, ATP). Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng P, muối phosphat vô cơ được dùng phổ biến là phosphate amon và phosphat kali có tác dụng cung cấp P và tạo ra tính đệm của môi trường.
Vitamin và các nguyên tố vi lượng khác như: S, Mg, Na, Fe, Ca, Zn, Cl, K mà VSV lấy từ môi trường dinh dưỡng là những chất cần thiết cho hoạt động sống của VSV. Chúng thường được sử dụng với lượng nhỏ nhưng tác dụng rất lớn và đa dạng, không thể thiếu được đối với hoạt động sống bình thường của VSV. Khi sử dụng môi trường thiên nhiên để nuối cấy VSV thường không cần thiết bổ sung các nguyên tố vi lượng này, vì trong nguyên liệu pha chế môi trường này (khoai tây, nước thịt, pepton) thường có đủ. Đối với môi trường tổng hợp (dùng nguyên liệu hóa chất) thì bắt buộc phải bổ sung các nguyên tốt vi lượng cần thiết.