2.4.1. Lựa chọn tác nhân kết tủa
C-DC được kết tủa bằng các dung môi Ethanol 960, Aceton 99,5% và dung dịch (NH4)2SO4. Cố định kết tủa ở nồng độ 70%, nhiệt độ lạnh là 40C và thời gian kết tủa là 30 phút. Sau khi kết tủa, đem ly tâm 12000v/phút ở nhiệt độ 40C trong 15 phút, loại bỏ dịch trong, thu được kết tủa nhão, đó là C-CPE. Cân lượng kết tủa nhão và xác định hoạt tính enzyme cellulase.
Quá trình nuôi cấy Hoạt độ Cellulase (UI/ml) Nhiệt độ thủy phân (X1)
Thời gian thủy phân (X2) pH (X3)
2.4.2. Lựa chọn nồng độ kết tủa
Sau khi chọn được tác nhân gây kết tủa, tiến hành chọn chế độ kết tủa lần lượt ở nồng độ khác nhau: 40; 50; 60; 70 và 80% trong thời gian 30 phút. Tiêu chuẩn để so sánh hiệu quả và lựa chọn phương pháp chiết tách enzyme thích hợp là khối lượng C-CPE thu được từ một lượng dịch chiết nhất định và hoạt tính cellulase của C-CPE phải cao nhất (so với hoạt độ của dịch chiết chứa cellulase).
2.4.3. Xác định tính chất lý hóa của C-CPE
Mỗi enzyme hoạt động ở một ngưỡng nhiệt độ và pH nhất định. Vì vậy xác định các điều kiện thích hợp cho hoạt tính của enzyme có ý nghĩa ứng dụng thực tiễn rất quan trọng.
Dịch nuôi cấy
Aceton 99,5%
Kết tủa lạnh ở nồng độ 70%
Ethanol 960 Ammonium suphate
C-CPE
Hoạt độ cellulase (UI/g)
- Chọn chất kết tủa TH
- Chọn nồng độ kết tủaTH Ly tâm lạnh
2.4.3.1. Xác định nhiệt độ phản ứng thích hợp
Hỗn hợp phản ứng của dịch C-CPE cellulase với dung dịch cơ chất 0,7% CMC (w/v) điều chỉnh bằng đệm natri acetate pH 5,5 được ủ ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng 30÷550C để tìm nhiệt độ phản ứng thích hợp.
2.4.3.2. Xác định pH phản ứng thích hợp
Để xác định pH thích hợp cho phản ứng xúc tác của enzyme, C-CPE cellulase được ủ với dung dịch cơ chất 0,7% CMC (w/v) điều chỉnh trong đệm natri acetate và potassium phosphate có pH từ 5,0÷7,0 hỗn hợp phản ứng được ủ ở 450C.
2.5. Thử nghiệm sản xuất bột rong thủy phân từ rong Mứt Porphyra vietnamensis
Sau khi xác định các tính chất lý hóa của C-CPE, tiến hành sản xuất bột rong thủy phân hòa tan theo các điều kiện đã lựa chọn và phân tích sơ bộ các thành phần hóa học của bột rong sản xuất được. Tham khảo một số quy trình sản xuất [21], dựa vào đặc điểm của sản phẩm và tính chất của nguyên liệu, luận văn đề xuất quy trình sản xuất bột rong thực phẩm theo sơ đồ sau:
C-CPE cellulase
Điều kiện pH, nhiệt độ
Hoạt độ cellulase (UI/g)
- Chọn pHopt - Chọn topt
C-CPE
Micromonospora
VTCC-A-1787
Rong Mứt tươi Ngâm rửa
Tẩy mùi Phơi nắng Rửa Sấy khô Nghiền nhỏ Thủy phân Nâng nhiệt Lắng và lọc Bột nhão
Đánh giá cảm quan Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật Xác định thành phần hóa học Sấy khô Bột rong Dịch trong
Thuyết minh quy trình
- Rong nguyên liệu: Rong được thu hái thủ công, rong ít tạp chất, cát sạn, có lẫn ốc nhỏ.
Hình 2.7. Mẫu rong mứt tươi Porphyra vietnamensis
- Ngâm rửa: Quá trình ngâm nước giúp loại bỏ các tạp chất lẫn trong rong như: cát, ốc, sò bám trên rong. Đồng thời làm cho một số chất màu, chất mùi, nước biển khuếch tán vào nước giúp hạn chế vi sinh vật phá hủy rong và nâng cao chất lượng bột rong. Rửa rong tươi 3 lần, có khuấy đảo, ở nhiệt độ phòng 300C, tỷ lệ nước rửa/rong tươi là 5/1 (v/w), thời gian là 15 phút/lần.
- Phơi nắng: Tia tử ngoại của ánh sáng mặt trời có khả năng tẩy trắng và làm khử mùi tanh của rong, giúp giảm ẩm độ nhằm tăng thời gian bảo quản. Rong khô phải được bảo quản trong bì hoặc túi nylông kín để tránh hút ẩm vì trên rong có rất nhiều muối. Để rong nơi khô ráo thoáng mát, thỉnh thoảng phải mang rong phơi lại. Phơi rong trong thời gian khoảng 24÷36 tiếng, nhiệt độ từ 30÷350C. Sau khi phơi tỷ lệ rong tươi/rong khô là 4/1, độ ẩm đạt ≤ 22%.
- Tẩy mùi: Rong Mứt có mùi tanh đặc trưng của thực vật thủy sinh, mùi tanh này rất khó chịu làm giảm giá trị cảm quan của thành phẩm sau này. Công đoạn này nhằm khử bớt mùi của rong, đồng thời làm mềm và bào mòn màng cellulose của cây rong, tạo điều kiện cho quá trình thủy phân nhanh và giảm bớt lượng tạp chất của phần cellulose. Acid cũng có tác dụng tăng cường oxy hóa và làm vỡ lớp ngoại bì chứa nhiều sắc tố, loại sắc tố ra khỏi cây rong và hòa tan chất màu của rong, có vai trò đáng kể trong việc cải thiện màu sắc của bột rong thu được sau này.
Hình 2.9. Mẫu rong ngâm xử lý CH3COOH 1%
Rong khô được xử lý trong môi trường acid CH3COOH 1%, tỷ lệ nước/rong khô là 10/1 (v/w), nhiệt độ phòng 300C, trong thời gian 2h, khuấy đảo liên tục. Rong được rửa lại bằng nước sạch đến khi nước rửa trung tính, tỷ lệ nước là 5/1 (v/w).
- Nghiền mịn: Cel trong tự nhiên thường ở dạng kết tinh thì có cấu trúc chặt chẽ nên khó bị phân hủy, do đó chuyển sang dạng kết tinh vô định hình dễ bị phân hủy bởi enzyme vsv. Sau khi ngâm, rong được vớt ra rửa kỹ đến trung tính, sấy khô, cắt nhỏ và xay mịn kích thước 1÷2 mm làm tăng diện tích tiếp xúc bề mặt giữa nguyên liệu và enzyme, tăng tốc độ thủy phân và giúp quá trình sấy được dễ dàng. Bột rong sạch, không còn bùn đất, tạp chất, có màu ánh tím.
Hình 2.10. Bột rong Mứt nguyên liệu
- Sấy khô: Nhiệt độ 500C, thời gian 1 tiếng, độ ẩm đạt ≤ 14%.
- Chế độ thủy phân: Thủy phân bột rong bằng C-CPE Micromonospora
VTCC-A-1787 với tỷ lệ C-CPE so với nguyên liệu là 2%. Quá trình thủy phân tiến hành ở nhiệt độ 450C, tại pH 6,0 với lượng nước cho thêm là 3:1 (v/w) so với nguyên liệu, lắc 180v/phút. Sau 48 giờ thủy phân, lấy mẫu tiến hành:
+ Đánh giá chất lượng sản phẩm bằng phương pháp cảm quan thông qua độ mủn, độ loãng, màu sắc, mùi của sản phẩm sau khi thuỷ phân.
+ Xác định hàm lượng đường khử, sự giảm trọng lượng cơ chất để đánh giá hiệu suất quy trình.
- Nâng nhiệt: Ở nhiệt độ 1000C, thời gian 15 phút có tác dụng diệt enzyme và cô đặc một phần dịch thủy phân rồi tiến hành làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng.
- Chế độ sấy chân không: Ở nhiệt độ 500C, thời gian là 2 giờ. Sau khi sấy, đánh giá sản phẩm bằng cách:
+ Đánh giá về giá trị dinh dưỡng.
+ Đánh giá cảm quan về trạng thái, màu, mùi.. + Đánh giá khả năng hòa tan của sản phẩm. + Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật
Số lượng và chất lượng bột rong, mức độ thủy phân cel và tỷ lệ hình thành đường khử sau quá trình thủy phân bị ảnh hưởng đáng kể bởi nhiều yếu tố khác nhau như: thành phần và tính chất rong nguyên liệu; nguồn gốc, hoạt lực và mức độ tinh sạch của enzyme; tỷ lệ giữa enzyme và nguyên liệu; nhiệt độ (0C); pH;
thời gian thủy phân; lượng nước bổ sung, sự khuấy trộn. Tuy nhiên đây chỉ là
những nghiên cứu bước đầu về ứng dụng C-CPE của chủng Micromonospora
VTCC-A-1787 trong khả năng thủy phân để sản xuất bột rong thực phẩm nên các thông số này đều được cố định.
2.6. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, kết hợp nghiên cứu hóa sinh. Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần, kết quả thí nghiệm được xác định là trung bình cộng của các lần thí nghiệm [7].
Số liệu thực nghiệm được biểu thị bằng bảng, biểu có sự hỗ trợ của công cụ toán học và thuật toán tối ưu để phát hiện các tính chất mới và mối quan hệ giữa các đại lượng. Xử lý theo phương pháp thống kê với sự hỗ trợ của phần mềm Microsot Excel 2010, Statgraphic Plus và được kiểm chứng bằng thực tế [9, 19, 20].
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao 3.1.1. Kết quả nghiên cứu lựa chọn chủng và môi trường lên men thích hợp 3.1.1. Kết quả nghiên cứu lựa chọn chủng và môi trường lên men thích hợp
Muốn thu nhận sản phẩm enzyme có chất lượng và hiệu suất cao thì việc chọn giống và môi trường nuôi cấy có ý nghĩa quyết định. Tiến hành so sánh dựa
trên 3 chủng Micromonospora được lấy từ Viện Vi sinh vật và Công Nghệ sinh học
(VTCC) - Trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Sau khi 3 ngày nuôi trong môi trường thạchYS, khuẩn lạc được cấy trong các môi trường nuôi cấy tổng hợp là Gause-I, ISP-4 và YS có 0,5% CMC làm chất cảm ứng ở 30ºC, pH 7,0 lắc 180v/phút, sau 72 giờ ly
tâm thu dịch nổi nuôi cấy. Định tính hoạt tính cellulase của 3 chủng Micromonospora này
được thể hiện mạnh trên đĩa thạch theo hình 3.1 và bảng 3.1 sau:
Bảng 3.1. Định tính cellulase của 3 chủng Micromonospora sau 3 ngày
Hoạt tính cellulase tương đối (D-d, mm) STT Ký hiệu chủng Gause-I ISP-4 YS 1 VTCC-A-1787 5 15 9 2 VTCC-A-1762 8 10 6 3 VTCC-A-1820 7 8 4 (a) (b)
(c) (c’)
Hình 3-1. Vòng phân giải cơ chất của chủng Micromonospora sau 3 ngày
VTCC-A-1762; (b) VTCC-A-1820; (c & c’) VTCC-A-1787
Mục đích của việc tuyển chọn là chọn ra giống Micromonospora có khả năng
tạo enzyme cellulase có hoạt tính cao nhất. Từ kết quả thực nghiệm bảng 3.1 và quan sát hình 3-1 ta thấy khi nuôi cấy 3 chủng ở trên 3 môi trường khác nhau thì trên đĩa thạch đều xuất hiện vòng phân giải cơ chất CMC với đường kính vòng phân giải rất
khác nhau. Như vậy, các chủng Micromonospora được khảo sát đều có sinh ra cellulase ngoại bào. Cụ thể chủng Micromonospora VTCC-A-1787 đạt vòng phân giải lớn nhất ở môi trường ISP-4 với đường kính 15mm, còn chủng Micromonospora VTCC-A-1762 đạt đường kính 10mm và Micromonospora VTCC-A-1820 đạt 8mm
ở cùng môi trường.
Kết quả trên cho thấy môi trường ISP-4 thích hợp cho cả 3 chủng xạ khuẩn này và chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có hoạt tính tương đối cao nhất. Như vậy, các xạ khuẩn tuy cùng một chi có cấu tạo tương đương nhau nhưng khác giống được nuôi cấy trong cùng một môi trường thì khả năng sinh enzyme là khác nhau và mỗi chủng chỉ thích hợp với 1 loại môi trường nuôi cấy sinh enzyme nhất định.
Dựa vào kết quả sơ bộ bằng phương pháp định tính enzyme cellulase trên
đĩa thạch, khả năng sinh tổng hợp cellulluase từ 3 chủng Micromonospora này trên
môi trường ISP-4 được xác định cụ thể bằng phương pháp định lượng. Sau 72 giờ
nuôi cấy chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có khả năng sinh C-DC có hoạt
tính cellulase cao nhất đạt 92 UI/ml. Kết quả được trình bày theo bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 3 chủng Micromonospora sau 3 ngày Chủng Hoạt tính (UI/ml) VTCC-A-1787 92,0 ± 0,011 VTCC-A-1762 64,8 ± 0,05 VTCC-A-1820 58,4 ± 0,025
Như vậy, mỗi vi sinh vật sinh trưởng và phát triển phù hợp với mỗi loại môi trường khác nhau nên khả năng sinh tổng hợp enzyme khác nhau.
Từ kết quả trên, chọn chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase cao nhất trong số 3 chủng Micromonospora nghiên cứu (Bảng 3.1, 3.2; Hình 3-1) theo phương pháp nuôi cấy lỏng trong môi trường ISP-4 sau 3 ngày nuôi cấy. Do đó, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 được chọn để tối ưu các điều kiện nuôi cấy và tinh sạch, đánh giá tính chất lý hóa của enzyme cellulase.
3.1.2. Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Micromonospora VTCC-A-1787 3.1.2.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý hóa 3.1.2.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý hóa
a. Quan sát đại thể: Khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch đĩa YS có màu cam, tròn đều và nhỏ, đường kính khuẩn lạc khoảng 0,7÷1mm, bề mặt xù xì và khô, cắm sâu vào môi trường thạch.
b. Đặc điểm sinh lý hóa: Tiến hành thử các phản ứng sinh hóa, kết quả được trình bày ở bảng 3.3:
Bảng 3.3. Mô tả đặc điểm sinh lý hóa Micromonospora echinospora
Các chỉ tiêu Mô tả
Khả năng hình thành enzyme ngoại bào (D-d, mm) trên môi trường ISP-4
+ Amylase trên cơ chất tinh bột
+ Protease trên cơ chất casein thủy phân
8 13
Khả năng chịu muối tối đa (%) 3
Khả năng phân giải carbohydrate + Glucose + Fructose + Manitol + Sucrose + Lactose + + - + + (+): Có phản ứng; (-): Không có phản ứng
Qua bảng 3.3 cho thấy chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có khả năng
lên men và sử dụng 4 nguồn đường là glucose, fructose, lactose và sucrose tạo các acid hữu cơ, các rượu, CO2 làm thay đổi pH của môi trường, dẫn đến thay đổi màu của chất chỉ thị. Chất chỉ thị phenol red từ màu đỏ chuyển sang vàng, đối chứng (+); đối với các loại đường còn lại không có khả năng đồng hóa nên có màu đỏ, đối chứng
(-) theo hình 3-3.
- Nồng độ muối có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn. Kết
quả cho thấy chủng Micromonospora VTCC-A-1787 có khả năng sử dụng nồng độ
muối tới 3% và ở nồng độ muối cao hơn thì chủng không phát triển được. Như vậy ở nồng độ muối 0,5% có tác dụng kích thích sự sinh trưởng chủng xạ khuẩn
Micromonospora VTCC-A-1787.
- Trong quá trình sống, để phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất đơn giản có thể hấp thu được, xạ khuẩn có khả năng tiết vào môi trường các enzyme ngoại bào. Sau khi tiến hành kiểm tra, kết quả cho thấy chủng
Micromonospora VTCC-A-1787 còn có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease và
amylase thủy phân mạnh casein, tinh bột.
3.1.2.2. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm nuôi cấy
a. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng Micromonospora VTCC- A-1787
Tiến hành nuôi cấy chủng Micromonospora VTCC-A-1787 trong 3 môi
trường khác nhau là YS, ISP-4, Gause-I ở nhiệt độ 30oC, pH 7,0. Xác định giá trị mật độ quang ở bước sóng 620nm (A620nm) ở các thời điểm nhau từ 24÷168 giờ. Kết quả cho thấy chủng có tốc độ phát triển khác nhau trong các môi trường khác nhau, do khả năng thích ứng và sử dụng dinh dưỡng trong môi trường khác nhau ở các giai đoạn nuôi cấy khác nhau. Đường cong sinh trưởng trong 3 môi trường nuôi cấy ở các thời điểm khác nhau được biểu diễn theo bảng 1 (phụ lục 2) và hình 3-4:
Quan sát đường cong sinh trường hình 3-4 cho thấy trong điều kiện nuôi cấy liên tục và không thay đổi môi trường nếu thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dưỡng càng giảm sút, các chất phế thải của trao đổi chất càng
tăng lên, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 sinh trưởng và phát triển qua 4
pha liên tiếp bao gồm: pha lag, pha logarit, pha cân bằng và pha suy vong.
Trong giai đoạn tiềm phát (pha lag), XK chưa phân chia nhưng trọng lượng và thể tích tế bào tăng rõ rệt trong thời kì này vì khi cấy chuyển từ môi
trường thạch sang môi trường lỏng, chủng Micromonospora VTCC-A-1787 bắt
đầu thích nghi và làm quen với môi trường mới, sau đó chúng sẽ cảm ứng và sinh ra các loại enzyme phân giải thành phần môi trường. Dựa vào hình 3-4 cho thấy, pha lag tính từ khi bắt đầu cấy chuyền, giai đoạn này là sau 24h ở MT YS với mật độ tế bào (OD620nm) cao nhất đạt 0,514, ở MT ISP-4 sau 39h là 0,489, ở MT Gause-I là sau 48 giờ đạt 0,651.
Đến giai đoạn logarit (pha log), mật độ tế bào tăng đột ngột vì các enzyme