CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3. Tối ưu hóa quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng của enzyme
4.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA đến quá trình biến
trình biến tính hợp chất puerarin
Tối ưu hóa q trình biến tính hợp chất puerarin được thực hiện bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, các nghiệm thức được bố trí theo mơ hình Box-Behnken. Ba yếu tố được lựa chọn cho quá trình là nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA. Hàm lượng puerarin tổng hợp được sau q trình biến tính được dùng để đánh giá hiệu quả của q trình chuyển hóa (Hình 4.8).
Hình 4.8: Dịch sắn dây sau khi ủ enzyme và lọc
Kết quả hàm lượng puerarin tính tốn theo mơ hình và hàm lượng đo cụ thể được thể hiện ở Bảng 4.7. Bảng 4.8 trình bày kết quả phân tích thống kê ANOVA cho việc tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng của enzyme BSMA.
Bảng 4.7: Sự thay đổi hàm lượng puerarin (mg/g) dưới ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA STT Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) Nồng độ (U/g tinh bột) Hàm lượng puerarin (theo thực nghiệm) Hàm lượng puerarin (theo mơ hình) 1 45 2 15 7,1067±0,0167 7,1122 2 45 6 15 7,1184±0,0340 7,1253 3 45 4 10 7,1192±0,0198 7,0855 4 45 4 20 7,1241±0,0257 7,1452 5 65 2 15 7,2483±0,0250 7,2242 6 65 6 15 7,2258±0,0308 7,2373 7 65 4 10 7,1829±0,0249 7,1975 8 65 4 20 7,2592±0,0042 7,2572 9 55 2 10 7,1004±0,0685 7,1191 10 55 2 20 7,0563±0,0192 7,0560 11 55 6 10 7,0091±0,0333 7,0094 12 55 6 20 7,2107±0,0562 7,1919 13 55 4 15 7,4782±0,0119 7,4840 14 55 4 15 7,4976±0,0433 7,4840 15 55 4 15 7,4762±0,0265 7,4840
*: giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm
Việc thăm dị và tối ưu hóa một bề mặt đáp ứng có thể tạo ra những kết quả khơng mong muốn, trừ khi mơ hình đó thể hiện sự phù hợp tốt thông qua việc kiểm định sự phù hợp của mơ hình (Liyana-Pathirana et al., 2005). Hệ số R2 được dùng để kiểm định mức độ phù hợp của mơ hình (Nath et al., 2007) và giá trị này lớn hơn 0,90 thể hiện mức độ phù hợp cao (Haaland et al., 1989). Giá trị R2 nhỏ thể hiện sự tương tác kém
Bảng 4.8: Kết quả phân tích thống kê ANOVA cho hàm lượng puerarin Mã hóa Tổng bình Mã hóa Tổng bình phương Độ tự do Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị p Model 1,01646 9 0,11294 90,54 0,0000 X4: nhiệt độ (0C) 0,075208 1 0,075208 82,90 0,0001
X5: thời gian (giờ) 0,00102704 1 0,00102704 1,13 0,3283
X6: nồng độ enzyme (U/g) 0,0213786 1 0,0213786 23,56 0,0028 X4X4 0,149055 1 0,149055 164,29 0,0000 X4X5 0,000873813 1 0,000873813 0,96 0,3643 X4X6 0,00382704 1 0,00382704 4,22 0,0858 X5X5 0,413573 1 0,413573 455,85 0,0000 X5X6 0,0452395 1 0,0452395 49,86 0,0004 X6X6 0,428437 1 0,428437 472,23 0,0000 Block 0,00147624 2 0,000738121 0,81 0,4868 Residual 0,0436594 35 0,00124741 Lack-of-fit 0,0367397 27 0,00136073 1,50 0,3230 Pure error 0,00544353 6 0,000907254 Total (corr.) 1,06012 44 R2 0,9602 Adj R2 0,9499
Kết quả phân tích thống kê ANOVA (Bảng 4.8) cho thấy mơ hình tương quan có ý nghĩa thống kê cao, giá trị cho hệ số R2 bằng 0,96. Ý nghĩa của mỗi hệ số được xác định thông qua kiểm định F và giá trị p. Kết quả Bảng 4.8 đã cho thấy giá trị F và p của mơ hình lần lượt là 90,54 và 0,00; điều đó có nghĩa là mơ hình đã được chấp nhận. Từ các số liệu thu thập được, mơ hình tương quan giữa hàm lượng puerarin tổng hợp được từ q trình chuyển hóa giữa các gốc đường maltose, glucose và phân tử puerarin và các nhân tố khảo sát (nhiệt độ, thời gian, nồng độ) đã được xây dựng và thể hiện ở phương trình 4.
Z = 1,59074 + 0,129549X4 + 0,32109X5 + 0,197767X6 – 0,00116001X42 – 0,000426667X4X5 + 0,000357167X4X6 – 0,0483066X52 + 0,00614X5X6 – 0,00786672X62 (4)
Trong đó: Z: puerarin (mg/g)
Các hệ số trong mơ hình bao gồm hệ số bậc một, hệ số bậc hai, hệ số tương tác đều có ý nghĩa (p<0,05), trong đó các hệ số khơng có ý nghĩa có thể được lược bỏ nhằm rút gọn phương trình. Phương trình (4) trở thành:
Z = 1,38994 + 0,133199X4 + 0,217411X6 + 0,297624X5 – 0,00116001X42 – 0,00786672X62 – 0,0483066X52 + 0,00614X5X6 (5)
Trong mơ hình này các hệ số tương tác giữa nhiệt độ-thời gian, nhiệt độ-nồng độ đã được lược bỏ. Hệ số tuyến tính thời gian (p = 0,32>0,05) tuy khơng có ý nghĩa nhưng vẫn được giữ trong mơ hình nhằm đảm bào tính hệ thống của mơ hình. Bên cạnh đó,
kiểm tra độ phù hợp của mơ hình thơng qua kiểm tra Lack of fit (p = 0,32) khơng có ý nghĩa thống kê càng khẳng định khả năng phù hợp của mô hình là rất cao.
Phương trình (6) được thiết lập để diễn tả sự tương thích giữa hàm lượng puerarin tổng hợp được theo thực nghiệm và hàm lượng puerarin theo mơ hình. Hệ số R2 bằng 0,9895 càng khẳng định dữ liệu dự đốn theo mơ hình và thực nghiệm có độ tương thích cao.
y = 0,9895 x + 0,0756 (6)
Hình 4.9: Biểu đồ thể hiện sự tương thích giữa hàm lượng puerarin theo thực nghiệm và theo mơ hình
Hình 4.10: Đồ thị sắc ký phân tích hàm lượng puerarin. (A) puerarin chuẩn (thời gian lưu 3,22 phút), (B) puerarin trong dịch thủy phân (thời gian lưu 3,23 phút)
Phân tích HPLC để xác định hàm lượng puerarin tổng hợp được với thời gian lưu của peurarin chuẩn và puerarin trong mẫu tương ứng được xác định là 3,22 phút và 3,23 phút.
(A)
(B)
(C)
Hình 4.11: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng của một số yếu tố đến q trình biến tính hợp chất puerarin dưới tác dụng của enzyme BSMA (mg/g)
A: ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ (ở nồng độ 15U/g bột) B: ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ (ở thời gian 4 giờ) C: ảnh hưởng của thời gian và nồng độ (ở nhiệt độ 55oC)
Để xem xét sự tương tác của các nhân tố ảnh hưởng, các đồ thị 3 chiều của mơ hình hồi quy khơng tuyến tính được trình bày ở Hình 4.11. Hình biểu diễn cho thấy cả
3 nhân tố (nhiệt độ, thời gian, nồng độ enzyme) cũng như sự tương tác của các cặp nhân tố (nhiệt độ-thời gian, thời gian-nồng độ, nhiệt độ-nồng độ) đều có ảnh hưởng đến hàm lượng puerarin tổng hợp được. Khi nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme tăng từ 45oC, 2 giờ và 10 U/g bột, tương ứng, đến giá trị tối ưu, thì hàm lượng puerarin tổng hợp được cũng tăng theo. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng ngồi giá trị tối ưu thì puerarin lại có chiều hướng giảm.
Các phản ứng chuyển hóa được biết đến để biến đổi một số đặc tính của các chất như glycoside. Có rất nhiều sản phẩm chuyển hóa được tạo thành giữa chất cho và nhiều loại chất nhận khác nhau bằng việc sử dụng enzyme riêng biệt để thực hiện các phản ứng chuyển hóa. Tính đặc hiệu của q trình chuyển hóa phụ thuộc vào loại enzyme, cấu hình của liên kết glycoside được tạo thành giữa phân tử chất cho và chất nhận (Park
et al., 2012). Các phương pháp chuyển hóa dùng enzyme có nhiều thuận lợi hơn so với
phương pháp hóa học trong việc tổng hợp các oligosaccharides và dẫn xuất của chúng như các bước phản ứng ít hơn, quy trình tinh chế đơn giản hơn và năng suất cao hơn (Park et al., 2012). Enzyme BSMA khơng những chuyển các mono và disaccharides mà cịn có khả năng chuyển nhiều hợp chất có cấu trúc khác nhau như hợp chất đường rượu, flavonoids (Lee et al., 1999) và acid ascorbic (Bae et al., 2002). Nhiều phân tử sinh học quan trọng có thể bị biến tính bằng phản ứng chuyển hóa dẫn đến các tính chất của chúng cũng thay đổi theo (Lee et al., 1999; Cho et al., 2000 ; Meulenbeld & Hartmans, 2000; Bae et al., 2002; Baek et al., 2003).
Cơ chế phản ứng của enzyme BSMA được Homa Torabizadeh & Ensieh Montazeri (2020) trình bày như sau: enzyme maltogenic amylase có khả năng cắt các liên kết trong phân tử amylose và amylopectin. Đối với amylose, BSMA có tác dụng cắt liên kết α-1,4 hiệu quả tạo thành các mạch oligosaccharide ngắn hơn bao gồm từ 2 đến 10 phân tử đường đơn liên kết với nhau. Đối với amylopectin, BSMA có tác dụng cắt liên kết α-1,4 tốt hơn so với liên kết α-1,6 tạo thành sản phẩm là các bó amylopectin có độ phân nhánh cao. Vì vậy, với nồng độ cơ chất sử dụng thấp, quá trình thủy phân tạo thành sản phẩm là các phân tử maltose vì vậy enzyme này có tên là “maltogenic amylase”. So sánh với CGTases hoạt tính chuyển glycoside của maltogenic amylase yếu hơn nhiều bởi vì maltogenic amylase chủ yếu chuyển cơ chất thành các sản phẩm thủy phân.
Choi et al., 2010 đã ứng dụng hoạt tính chuyển hóa của BSMA để cải thiện độ hịa tan của puerarin với cơ chất sử dụng là maltodextrin. Kết quả phản ứng chuyển hóa puerarin sử dụng BSMA thô tạo ra sản phẩm với tỷ lệ lượng tương đối của các chất maltosyl-α-(1-6)-puerarin, glucosyl-α-(1-6)-puerarin, glucosyl-α-(1-3)-puerarin và puerarin được xác định tương ứng là 26:18:7:49. Trải qua quá trình tinh sạch 2 bước, thu được 1,7 g các sản phẩm chuyển hóa của puerarin từ 3 g puerarin. Park et al. (2012) cũng đã nghiên cứu quá trình biến đổi sinh học của hợp chất isoflavone bằng hoạt tính
tạo thành liên kết α-(1,6)-glycoside. Hai sản phẩm chính của q trình chuyển hóa lần lượt là các chất glucosyl-α-(1,6)-puerarin và maltosyl-α-(1,6)-puerarin. Sử dụng enzyme chuyển hóa BSMA khơng những cải thiện độ hịa tan trong nước của puerarin mà cịn duy trì đầy đủ hoạt tính chống oxy hóa và hạ cholesterol máu của puerarin (Li et al., 2004; Chung et al., 2008).
Kết quả phân tích cho thấy ở nhiệt độ 55°C, thời gian 4 giờ và nồng độ enzyme BSMA 15 U/g bột, hàm lượng puerarin tổng hợp được là cao nhất (dao động từ 7,4762 mg/g đến 7,4976 mg/g). Từ kết quả thu được từ mơ hình, điều kiện tối ưu của q trình chuyển hóa cũng đã được xác lập như sau: nhiệt độ 57,48°C, thời gian 4,05 giờ và nồng độ enzyme 15,46 U/g tinh bột. Khi tiến hành thủy phân bột sắn dây với điều kiện tối ưu dưới tác dụng của enzyme β-amylase và BSMA, hàm lượng puerarin tổng hợp được là 7,51±0,02 mg/g, kết quả này khơng khác biệt có ý nghĩa so với kết quả dự đốn từ mơ hình (7,49 mg/g) ở độ tin cậy 95%.
Phương pháp bề mặt đáp ứng theo mơ hình Box-Behnken được áp dụng để tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây cũng như q trình biến tính hợp chất puerarin để cải thiện độ hòa tan trong nước của puerarin. Quá trình thủy phân bột sắn dây dưới tác dụng của β-amylase ở điều kiện tối ưu 54,34oC, nồng độ enzyme 41,46 U/g bột với thời gian 4,24 giờ thì hàm lượng đường khử thu được là cao nhất 161,07±2,96 mg/g. Hàm lượng puerarin tổng hợp được khi phân tích sắc ký lỏng cao áp là 7,5085±0,02 mg/g ở điều kiện tối ưu như sau: 57,47 oC; 4,05 giờ; BSMA 15,45 U/g bột.