Mã hóa Tổng bình phương Độ tự do Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị p Model 8482,19 9 942,465 288,72 0,0000 X1: nhiệt độ (0C) 214,421 1 214,421 82,96 0,0001
X2: thời gian (giờ) 78,1974 1 78,1974 30,25 0,0015
X3: nồng độ enzyme (U/g) 226,544 1 226,544 87,65 0,0001 X1X1 4685,43 1 4685,43 1812,79 0,0000 X1X2 0,00811133 1 0,00811133 0,00 0,9571 X1X3 168,089 1 168,089 65,03 0,0002 X2X2 541,46 1 541,46 209,49 0,0000 X2X3 53,2249 1 53,2249 20,59 0,0039 X3X3 3423,98 1 3423,98 1324,74 0,0000 Block 12,4515 2 6,22573 2,41 0,1706 Residual 114,25 35 3,26429 Lack-of-fit 86,2908 27 3,19596 1,24 0,4278 Pure error 15,5079 6 2,58465 Total (corr.) 8596,44 44 R2 0,988 Adj R2 0,985
Từ các số liệu thu thập được, mơ hình tương quan giữa hàm lượng đường khử tạo thành và các nhân tố khảo sát (nhiệt độ, thời gian, nồng độ) đã được xây dựng và được thể hiện ở phương trình (1). Kết quả phân tích thống kê ANOVA (Bảng 4.5) cho thấy mơ hình tương quan có ý nghĩa thống kê cao, giá trị cho hệ số R2 = 0,988. Ý nghĩa của mỗi hệ số được xác định thông qua kiểm định F và giá trị p. Đối với bất kỳ một điều kiện nào của mơ hình thì giá trị F lớn và giá trị p nhỏ sẽ chỉ ra một tác động đáng kể đối với các biến đáp ứng tương ứng. Kết quả Bảng 4.5 đã cho thấy giá trị F và p của mơ hình lần lượt là 288,72 và 0,0000, điều đó có nghĩa là mơ hình đã được chấp nhận. Y = - 520,813 + 21,5708X1 + 16,9202X2 + 2,8513X3 – 0,205667X12 + 0,00129995X1X2 + 0,0187132X1X3 – 1,74789X22 – 0,052651X2X3 – 0,0439538X32 (1)
Trong đó: Y: đường khử (mg/g), X1 (oC): nhiệt độ thủy phân, X2 (giờ): thời gian thủy phân, X3 (U/g bột): nồng độ enzyme
Các hệ số trong mơ hình bao gồm hệ số bậc một, hệ số bậc hai, hệ số tương tác đều có ý nghĩa (p<0,05), trong đó hệ số tương tác giữa 2 nhân tố nhiệt độ và thời gian khơng có ý nghĩa (p = 0,9571 > 0,05), do đó hệ số này có thể được lược bỏ nhằm rút gọn phương trình, phương trình (1) trở thành:
Y = - 521,099 + 21,576X1 + 2,8513X3 + 16,9917X2 – 0,205667X12 – 0,0439538X32 – 1,74789X22 + 0,0187132X1X3 – 0,052651X2X3 (2)
y = 0,9989 x + 0,1478 (3)
Mức độ phù hợp của mơ hình cũng đã được đánh giá thông qua giá trị F của Lack of fit. Mơ hình tương quan tốt cần sự phù hợp giữa giá trị thực tế và lý thuyết, vì vậy mơ hình thu được với kiểm định Lack of fit (kiểm định sự khơng phù hợp) khơng có ý nghĩa thống kê là điều mong muốn (Zabeti et al., 2009). Dữ liệu thu được từ Bảng phân tích thống kê (Bảng 4.5) cho thấy giá trị p = 0,4278>0,05 của Lack of fit khơng có ý nghĩa thống kê nên khả năng phù hợp của mơ hình là rất cao.
Hình 4.5: Biểu đồ sự tương thích giữa hàm lượng đường khử theo thực nghiệm và theo mơ hình
Để xem xét sự tương tác của các nhân tố ảnh hưởng, các đồ thị 3 chiều của mơ hình hồi quy khơng tuyến tính đã được biểu diễn trong Hình 4.6. Hình biểu diễn cho thấy cả ba nhân tố (nhiệt độ, thời gian, nồng độ enzyme) cũng như sự tương tác của các cặp nhân tố (nhiệt độ-thời gian, thời gian-nồng độ, nhiệt độ-nồng độ) đều có ảnh hưởng đến hàm lượng đường khử tạo thành.
Phương trình (2) cho thấy khi tăng nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme, hàm lượng đường khử tạo ra cũng tăng theo. Trong đó, hệ số tuyến tính của X1 (21,576)>X2 (16,9917) >X3 (2,8513). Điều này chứng tỏ nhiệt độ và thời gian là 2 nhân tố có ảnh hưởng đến lượng đường khử tạo thành nhiều hơn nồng độ enzyme.
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Trong các phản ứng sinh học, khi nhiệt độ tăng, khả năng xúc tác của enzyme sẽ tăng. Tuy nhiên, do bản chất enzyme là protein không bền nhiệt nên tốc độ phản ứng có một giới hạn nhất định, quá giới hạn đó tốc độ phản ứng sẽ giảm (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2004). Tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme, loại cơ chất, pH mơi trường… mà nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme có thể thay đổi. Kết quả Bảng 4.5 và Hình 4.6-A, Hình 4.6-C cũng cho thấy hàm lượng đường khử tăng khi nhiệt độ thủy phân tăng từ 45 lên 55°C, nhưng khi tiếp tục tăng nhiệt độ đến 65°C thì hàm lượng đường khử lại giảm. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với lý thuyết, khi tăng nhiệt độ làm cho động năng của enzyme và cơ chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều hơn. Các phức chất emzyme-cơ chất hình thành nhiều hơn, phản ứng xảy ra nhanh hơn. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao, enzyme
bị biến tính. Khi cấu hình trung tâm hoạt động của enzyme khơng cịn phù hợp với cơ chất, enzyme mất hoạt tính xúc tác. Khi nhiệt độ hạ thấp hơn nhiệt độ tối ưu, cơ chất và phân tử enzyme chuyển động chậm. Tần số va chạm giữa chúng thấp, kết quả là ít phức hợp enzyme-cơ chất được hình thành và tốc độ phản ứng sẽ giảm. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước đây. Năm 1974, Shinke et al. đã cho rằng nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính của β-amylase từ Streptomyces sp. là 50°C đến 60°C. Trong khi β-amylase từ Curculigo pilosa có nhiệt độ tối thích 55°C (Dicko et al., 1999). Sự biến tính protein ở nhiệt độ cao hơn 70°C cũng được nghiên cứu bởi Gupta et al. (2003).
Trong sản xuất việc xác định được thời gian thủy phân hợp lý có ý nghĩa quan trọng về mặt kỹ thuật. Theo Crabb & Mitchinson (1997) tốc độ phản ứng sẽ tăng theo thời gian phản ứng do enzyme có thời gian để tiếp xúc với cơ chất. Thời gian thủy phân càng kéo dài thì phản ứng càng xảy ra triệt để và đạt thông số kỹ thuật cao (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv.,1998). Tuy nhiên, với một lượng cơ chất nhất định, đến một giai đoạn nào đó của phản ứng thủy phân khả năng xúc tác của enzyme sẽ giảm. Enzyme tạo ái lực với các sản phẩm tạo thành của phản ứng và cơ chất, các sản phẩm sinh ra đóng vai trị như chất kìm hãm khơng cạnh tranh và kìm hãm hoạt động của enzyme (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2004). Hình 4.6-A, Hình 4.6-B cũng đã khẳng định một lần nữa nhận định trên, khi thời gian tăng từ 2 đến 4 giờ thì hàm lượng đường khử tạo thành cũng tăng theo, tuy nhiên nếu tiếp tục tăng thời gian thủy phân đến 6 giờ thì hàm lượng đường khử có chiều hướng giảm.
Tương tự như nhiệt độ và thời gian, nồng độ enzyme cũng có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Trong trường hợp cơ chất cố định và nồng độ enzyme tăng dần, ban đầu tốc độ phản ứng tăng nhanh do môi trường thừa cơ chất. Sau một thời gian, cơ chất bị phân giải dần và giảm nồng độ nên tốc độ phản ứng khơng tăng lên nữa mà có khuynh hướng giảm dần hoặc ngừng hẳn khi gặp điều kiện bất lợi (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv., 1998). Kết quả thực nghiệm ở Bảng 4.5 và mơ hình bề mặt đáp ứng Hình 4.6-B, Hình 4.6-C cũng cho thấy khi nồng độ enzyme tăng thì lượng đường khử tạo thành tăng, tuy nhiên sự thay đổi lượng đường khử còn phụ thuộc vào 2 nhân tố nhiệt độ và thời gian. Ở nhiệt độ 55°C, thời gian 4 giờ và nồng độ enzyme 40 U/g tinh bột thì lượng đường khử tạo thành là cao nhất (dao động từ 159,57 mg/g đến 160,11 mg/g).
Từ kết quả thu được từ mơ hình, điều kiện thủy phân tối ưu cũng đã được xác lập như sau: nhiệt độ 54,34oC, thời gian 4,24 giờ và nồng độ enzyme 41,46 U/g tinh bột. Tiến hành thủy phân bột sắn dây dưới điều kiện tối ưu, kết quả hàm lượng đường khử tạo thành 161,07±2,96 mg/g và kết quả này cũng khơng khác biệt có ý nghĩa so với kết quả dự đốn từ mơ hình 160,225 mg/g ở độ tin cậy 95%.
(A)
(B)
(C)
Hình 4.6: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng của một số yếu tố đến hàm lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột sắn dây bằng β-amylase (mg/g)
A: ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ (ở nồng độ 40U/g bột) B: ảnh hưởng của thời gian và nồng độ (ở nhiệt độ 55oC) C: ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ (ở thời gian 4 giờ)
4.3. Tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng của enzyme BSMA
4.3.1. Ảnh hưởng của pH đến q trình biến tính hợp chất puerarin dưới tác dụng của enzyme BSMA
Kết quả thống kê sự thay đổi hàm lượng puerarin dưới ảnh hưởng của pH được thể hiện trong Bảng 4.6.