Phương pháp Puerarin (%) Daidzein (%)
MAE-HPLC-FD 0,585±0,028 0,0405±0,0032
MAE-HPLC-UV 0,549±0,033
(Nguồn: Liu et al., 2011)
Wu et al. (2013) đã nghiên cứu các điều kiện tối ưu để trích ly puerarin từ Radix
Pueraria bằng kỹ thuật vi sóng. Khi sử dụng ethanol làm dung mơi trích ly, tác giả đã
cho thấy sự khác biệt khi so sánh với dung môi hữu cơ khác: nồng độ ethanol thấp, thời gian vi sóng cũng như mức năng lượng sử dụng đều thấp hơn. Kết quả các thông số tối ưu thu được: nồng độ ethanol 52,36%, thời gian chiếu vi sóng 60 giây, năng lượng vi sóng 184,8 W, tỷ lệ dung môi:nguyên liệu 25:1 (mL/g) tương ứng với hàm lượng puerarin 11,97 mg/g.
2.9.2. Hoạt tính chống oxy hóa
Bảng 2.15: Hàm lượng các hợp chất trong sắn dây ứng với các quá trình xử lý nhiệt khác nhau
Chỉ tiêu Nguyên liệu thô Nấu Nướng Hấp Chiên
TPC (mg GAE/g) 1,67±0,13 2,08±0,08 1,05±0,09 1,71±0,17 2,21±0,18 TFC (mg CAE/g) 0,3±0,03 0,21±0,02 0,23±0,02 0,3±0,02 0,29±0,03 CTC (mg CAE/g) 0,93±0,06 1,23±0,12 1,35±0,1 1,75±0,06 3,8±0,21
(Nguồn: Chen et al., 2016)
Bảng 2.16: Hàm lượng isoflavone trong sắn dây với các quá trình xử lý nhiệt khác nhau
Chỉ tiêu Nguyên
liệu thô Nấu Nướng Hấp Chiên
7-O-β-glucoside Puerarin (µg/g) 443,25±7,5 1398,4±53,1 423,65±116,7 659,15±33,8 301,65±4,4 Daidzin (µg/g) 203,2±46,3 648,6±64,5 215,9±53,3 284,95±128,3 167,85±24,6 Genistin (µg/g) 12,3±6,9 14,5±6,3 10,5±3,8 8,6±5,2 22,3±16,4 Glycitin (µg/g) 56,85±2,5 97,3±15,8 52,75±4,6 74,75±23,2 20,75±1,2 β-glucoside tổng 715,6 2110,1 702,75 1027,4 512,5 Aglycones Daidzein (µg/g) 44±0,4 8,8±0,05 42,1±9,65 7±2,7 17±0,3 Genistein (µg/g) 11,1±1,4 KPH 10,7±1,44 KPH 7,7±0,2 Aglycones tổng 55,1 8,8 52,8 7 24,7 Isoflavone tổng 770,7 2118,9 755,6 1034,4 537,2
(Nguồn: Chen et al., 2016)
Để đánh giá ảnh hưởng của phương pháp chế biến đến tính chất sinh hóa của sắn dây P. thomsonii được trồng ở tỉnh Chu Hải (Trung Quốc), Chen et al. (2016) đã so sánh
hàm lượng của các hợp chất phenol, flavonoid, tannin, isolavones và khả năng chống oxy hóa có trong sắn dây đã xử lý nhiệt với mẫu nguyên liệu thô bằng phương pháp so màu và HPLC. Phương pháp DPPH và ABTS đã được sử dụng để xác định hoạt tính chống oxy hóa. Kết quả đã chỉ ra rằng q trình chiên làm tăng phần lớn các hợp chất có trong sắn dây cũng như làm tăng khả năng chống oxy hóa của chúng (Bảng 2.15). Quá trình nấu và hấp làm gia tăng hàm lượng isoflavones từ 0,77 mg/g (sắn dây nguyên liệu) lên 2,12 mg/g (sắn dây đã nấu) và 1,03 mg/g (sắn dây đã hấp) (Bảng 2.16). Các kết quả này cho thấy quá trình gia nhiệt đều làm tăng hàm lượng các hợp chất có trong sắn dây và khả năng chống oxy hóa cũng tăng.
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1.1. Địa điểm nghiên cứu 3.1.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Các phịng thí nghiệm Khoa Nơng nghiệp và Cơng nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Tiền Giang;
Trung tâm Kỹ thuật và Công nghệ sinh học, Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Tiền Giang;
Trung tâm Tư vấn và Kiểm định chất lượng nông lâm thủy sản, Sở NN&PTNT tỉnh Tiền Giang;
Công ty Rau quả Tiền Giang, Doanh nghiệp tư nhân Long Thuận (Tiền Giang).
3.1.1.2. Thời gian nghiên cứu
Quyết định công nhận nghiên cứu sinh số 1577/QĐ-ĐHCT ngày 29/5/2015 của Hiệu trưởng Trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian đào tạo theo hệ không tập trung là 4 năm (từ tháng 6/2015 đến tháng 6/2019).
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 3.1.2.1. Thiết bị và dụng cụ 3.1.2.1. Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ dùng trong q trình thí nghiệm được trình trong bảng 3.1. Bảng 3.1: Thiết bị và dụng cụ dùng trong quá trình nghiên cứu
STT Thiết bị Model Nước sản xuất
1 Tủ sấy Memmert Schutzart DIN
40050-IP20
Đức
2 Máy đo quang phổ UV-Vis, Varian Casy 50 EL04123327 Mỹ
3 Máy đo pH Hanna HI 99161 Rumani
4 Thiết bị sắc ký HPLC Chromaster L-
5000 Series
Hitachi, Nhật
5 Cân điện tử 2 số A&D EK 610i Nhật
6 Cân phân tích Sartorius 324S Đức
7 Máy ly tâm lạnh Rotina 380R Đức
8 Máy lắc ống nghiệm Vortex Đức
9 Chiết quang kế Atago 0-32Bx Nhật
10 Kính hiển vi MT4200L Nhật
11 Tủ cấy vi sinh Sanyo MCV-711ATS Nhật
12 Tủ lạnh Sharp 18VF2 Nhật
13 Máy cất nước 2 lần A4000D Anh
14 Micropipet Nichiryo NPX-1000 Nhật
15 Máy lắc ngang RS 10 Trang Quốc
16 Ống sinh hàn Đức
STT Thiết bị Model Nước sản xuất
18 Buồng đếm hồng cầu tráng bạc Đức
19 Cột sắc ký C18 Restek, Mỹ
20 Vial chai nâu, 2 mL Pháp
21 Các thiết bị và dụng cụ khác
3.1.2.2. Hóa chất
Các loại hóa chất sử dụng bao gồm: Puerarin chuẩn (Sigma, Mỹ), Maltose (Đức, độ tinh khiết 99%), Ethanol (Đức, độ tinh khiết 99%), Methanol (Đức, độ tinh khiết 99%), Beta cyclodextrin (Đức, độ tinh khiết 99%), I2 (Đức, độ tinh khiết 99%), Nước cất (Đức), HCl (Trung Quốc, độ tinh khiết 36%), Natri citrate (Trung Quốc, độ tinh khiết 99%), H2SO4 (Trung Quốc, độ tinh khiết 99%), KI (Đức, độ tinh khiết 99%), KIO3 (Trung Quốc, độ tinh khiết 99%), Tinh bột (Trung Quốc, độ tinh khiết 99%), Thuốc thử DNS (Trung Quốc), NaOH (Trung Quốc, độ tinh khiết 99%), K3Fe(CN)6 (Trung Quốc, độ tinh khiết 99%), Đường glucose (Trung Quốc, độ tinh khiết 99%) và một số loại hóa chất khác.
3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Nguyên liệu 3.2.1. Nguyên liệu
Sắn dây (Pueraria thomsonii Benth) dùng trong quá trình nghiên cứu là sắn dây được trồng tại xã Hồnh Sơn, huyện Kinh Mơn, tỉnh Hải Dương, thu hoạch sau một năm trồng sau mỗi đợt lấy mẫu.
Sắn dây được cắt lát và sấy khô đến khối lượng không đổi ở 70oC, bảo quản trong tủ mát (5oC), được sử dụng tối đa 1 năm, định kỳ mỗi đợt lấy mẫu, tiến hành phân tích và đo đạc để đồng nhất chất lượng mẫu.
Dứa (Ananas comosus) giống dứa Queen, được trồng tại xã Thạnh Mỹ, huyện Tân Phước, tỉnh Tiền Giang. Dứa dùng trong q trình nghiên cứu là loại dứa chín, khối lượng trung bình 0,5 kg/trái.
Bột maltodextrin (độ tinh khiết 99%) cơng nghiệp được cung cấp bởi cơng ty hóa chất Hóa Nam, 239/4 Lý Thường Kiệt, phường 15, quận 11, thành phố Hồ Chí Minh.
Chế phẩm enzyme β-amylase được cung cấp bởi công ty Novozymes, dạng lỏng, nhiệt độ và pH tối ưu là 50oC, 6.
Chế phẩm enzyme BSMA được cung cấp bởi công ty DMS (Singapore), dạng rắn, nhiệt độ và pH tối ưu là 60oC, 5,5.
Giống nấm men Saccharomyces oviformis từ Phịng thí nghiệm Công nghệ sinh
học, Trường Đại học Cơng nghệ Sài Gịn, 180 Cao Lỗ, phường 4, quận 8, TP.HCM.
Bảng 3.2: Các phương pháp phân tích
STT Chỉ tiêu Phương pháp phân tích
1 Tổng hàm lượng chất khơ hịa tan Dùng chiết quang kế Atago 0-32
2 Độ ẩm (%) AOAC 934.06
3 pH Xác định bằng máy đo pH
4 Hàm lượng đường tổng (%) TCVN 4594-88
5 Hàm lượng đường khử (mg/g) Theo phương pháp của Miller, 1959
6 Hàm lượng amylose Theo phương pháp của Juliano, 1971
7 Hàm lượng amylopectin Theo phương pháp của Juliano, 1971
8 Hàm lượng tinh bột (%) TCVN 4594-88
9 Hàm lượng ethanol TCVN 5562-2009
10 Số tế bào nấm men (cfu/mL) Đếm trên buồng đếm hồng cầu
11 Hàm lượng puerarin Phân tích HPLC (theo phương pháp của
Zhang và cộng sự 2004)
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng qt
Phân tích thành phần hóa học của ngun liệu.
Nội dung 1: Tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của
enzyme β-amylase thông qua việc khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme β-amylase.
Nội dung 2: Tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác
dụng của enzyme BSMA thông qua việc khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA.
Nội dung 3: Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa-sắn dây thơng qua việc khảo
sát ảnh hưởng của pH, Brix, tỷ lệ nấm men trong điều kiện lên men ở nhiệt độ thường. Đánh giá chất lượng sản phẩm nước uống lên men từ sắn dây và dứa.
Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Thuyết minh quy trình
Sắn dây sau khi sấy khô sẽ được đem đi nghiền mịn và xác định các chỉ tiêu phân tích.
Hồ hóa: nhằm phá vỡ màng tế bào của tinh bột sắn dây, giúp cho tinh bột hòa tan trong nước dễ dàng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân
Đường hóa: nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho q trình chuyển hóa tinh bột thành đường (maltose và các dextrin). Giai đoạn này được thực hiện dưới tác dụng của enzyme β-amylase.
Xử lý BSMA: dung dịch sắn dây trong giai đoạn đường hóa sẽ tạo ra đường
Quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β- amylase, pH, nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme β-amylase.
Tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin- maltose dưới tác dụng của enzyme BSMA thông qua việc khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA.
Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa-sắn dây thông qua việc khảo sát ảnh hưởng của pH, Bx, tỷ lệ nấm men trong điều kiện lên men ở nhiệt độ thường.
Đánh giá chất lượng sản phẩm nước uống lên men từ sắn dây và dứa.
Đánh giá chất lượng sản phẩm nước uống lên men từ sắn dây và dứa.
đường này vào các đường maltose-oligosaccharide khác theo liên kết 1-6 glucoside giúp tạo thành đường IMO cũng như làm thay đổi cấu trúc puerarin từ dạng không tan thành dạng tan trong nước. Trong quá trình xử lý BSMA bổ sung 10% maltodextrin và dung dịch đệm natri citrate để tăng hoạt tính của enzyme.
Sau mỗi q trình xử lý enzyme đều có cơng đoạn vơ hoạt enzyme để khơng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme sau đó.
Nấu: nhằm mục đích dừng các phản ứng thủy phân bởi các enzyme trên đồng thời tiêu diệt các vi sinh vật gây hại có thể ảnh hưởng đến q trình lên men.
Làm nguội: nấm men khơng thể chịu được nhiệt độ cao, do đó cần tiến hành làm nguội dịch lên men đến nhiệt độ tối thích cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men (thường ở 28 ‒ 30oC). Đồng thời làm nguội nhằm đảm bảo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men.
Phối chế: nhằm tạo môi trường thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men giúp quá trình lên men đạt hiệu quả cao. Ở giai đoạn này cần xác định các giá trị pH, Brix, nhiệt độ thích hợp cho q trình lên men.
Lên men chính: nhằm mục đích chính là chuyển đường thành rượu.
Lọc thô: nhằm loại bỏ phần xác, bã sắn dây và dứa nguyên liệu sau khi lên men chính, mang lại giá trị cảm quan cho sản phẩm.
Lên men phụ: nhằm ổn định chất lượng nước uống lên men, làm sáng trong và làm tăng hương cho sản phẩm.
Hình 3.2 trình bày quy trình nhân giống Saccharomyces oviformis ở quy mơ phịng thí nghiệm.
Quy trình nhân giống nấm men
Lọc: dịch thủy phân tinh bột sắn dây và dứa sau khi phối trộn tiến hành lọc nhằm loại bỏ bã, tạp chất, cặn có trong dung dịch.
Cân bằng dinh dưỡng: nhằm tạo mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men.
Tiệt trùng: nhằm tiêu diệt các vi sinh vật có trong dịch sắn dây-dứa đồng thời đảm bảo mơi trường vô trùng tuyệt đối giúp nấm men sinh trưởng và phát triển thuận lợi.
Nhân giống: giúp cung cấp đủ lượng giống cho quá trình lên men đồng thời để giữ giống.
3.3.2. Bố trí thí nghiệm
3.3.2.1. Phân tích thành phần hóa học của ngun liệu sắn dây a. Mục đích
Sắn dây là loại nguyên liệu có thành phần dinh dưỡng phù hợp cho các sản phẩm lên men, tuy nhiên các thành phần này thường thay đổi theo điều kiện khí hậu, đất đai, vùng trồng. Vì vậy, việc phân tích các thành phần cơ bản của nguyên liệu trước khi tiến hành thí nghiệm là một điều rất cần thiết.
b. Các chỉ tiêu phân tích ‒ Độ ẩm ‒ Hàm lượng puerarin ‒ Hàm lượng đường tổng số ‒ Hàm lượng amylose ‒ Hàm lượng amylopectin ‒ Hàm lượng tinh bột
Nội dung 1: Tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
3.3.2.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
a. Mục đích
Xác định nồng độ cơ chất thích hợp cho q trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase để hàm lượng đường khử tạo thành là cao nhất.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 1 nhân tố khảo sát, các nhân tố cịn lại được cố định (Hình 3.3).
Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây
Nhân tố A: nồng độ cơ chất thay đổi ở 5 mức độ
A1: 8% A2: 10%
A3: 12% A4: 14%
A5: 16%
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 3 = 15
Tiến hành thí nghiệm:
Mẫu bột sắn dây tương ứng với các nồng độ khảo sát 8, 10, 12, 14 và 16%, pH 5,5 sẽ được đem đi hồ hóa với nước trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 90oC. Sau khi hồ hóa, dịch hồ tinh bột được hạ nhiệt độ xuống 60oC, thực hiện q trình đường hóa với việc bổ sung enzyme β-amylase ở nồng độ 20 U/g tinh bột, tiến hành đường hóa trong thời gian 2 giờ. Dịch thủy phân sau đường hóa sẽ được vơ hoạt enzyme ở nhiệt độ 90oC, 15 phút, sau đó lọc và xác định hàm lượng đường khử sinh ra.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng đường khử.
3.3.2.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
a. Mục đích
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 1 nhân tố khảo sát, các nhân tố còn lại được cố định (Hình 3.4).
Nhân tố B: giá trị pH, thay đổi ở 5 mức độ:
B1: 5 B2: 5,5
B3: 6 B4: 6,5
B5: 7
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 3 = 15
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của pH đến q trình thủy phân tinh bột sắn dây
Tiến hành thí nghiệm:
Mẫu 5 g bột sắn dây ứng với nồng độ cơ chất tìm được từ thí nghiệm 1 sẽ đem đi hồ hóa ở 90oC trong 30 phút. Thí nghiệm được tiến hành tương tự thí nghiệm 1 nhưng giá trị pH được thay đổi ở 5 mức độ 5 đến 7 (sử dụng dung dịch đệm để điều chỉnh pH dung dịch).
Dịch thủy phân sau đường hóa sẽ được vơ hoạt enzyme ở nhiệt độ 90oC, 15 phút, sau đó lọc và xác định hàm lượng đường khử sinh ra.
3.3.2.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme β-amylase đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây
a. Mục đích
Xác định được giá trị nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme tối ưu để thu được hàm lượng đường khử cao nhất và đồng thời là cơ sở giúp các quá trình chế biến tiếp theo đạt hiệu suất cao.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 nhân tố khảo sát, các nhân tố còn lại được cố định. Phương pháp bề mặt đáp ứng theo mơ hình Box-Behnken được sử dụng để xác định các thông số tối ưu của 3 nhân tố khảo sát (nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme). Mức độ của các nhân tố được thể hiện ở Bảng 3.3, sơ đồ bố trí thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.4.
Bảng 3.3: Các nhân tố và mức độ khảo sát trong quá trình thủy phân tinh bột sắn dây
Ký hiệu Nhân tố Đơn vị Mức độ
C Nhiệt độ °C Giờ U/g tinh bột 45 55 65 D Thời gian 2 4 6 E Nồng độ 20 40 60
Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken
Số TT Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) Nồng độ
(U/g tinh bột) 1 45 2 40 2 45 6 40 3 45 4 20 4 45 4 60 5 65 2 40 6 65 6 40 7 65 4 20 8 65 4 60 9 55 2 20 10 55 2 60 11 55 6 20 12 55 6 60 13 55 4 40 14 55 4 40 15 55 4 40
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ β-amylase đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây