STT Maltose 1 mg/mL (mL) Nước cất (mL) Thuốc thử DNS (mL) Nồng độ maltose (mg/mL) 1 0 2 6 0 2 0,2 1,8 6 0,1 3 0,4 1,6 6 0,2 4 0,6 1,4 6 0,3 5 0,8 1,2 6 0,4 6 1 1 6 0,5
Dùng 1 miếng nilon sạch bịt kín đầu ống nghiệm, đặt vào cốc nước đang sôi trong 5 phút.
Làm lạnh về nhiệt độ phòng và đo độ hấp thu OD ở bước sóng 540 nm. Dùng ống nghiệm đối chứng để chuẩn độ truyền suốt về 100%. Chú ý là tất cả các ống nghiệm phải được làm lạnh về nhiệt độ phịng trước khi đo vì độ hấp thu rất nhạy cảm với nhiệt độ.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên giữa nồng độ đường và độ hấp thu OD ở bước sóng 540 nm. Vẽ đường chuẩn maltose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ maltose.
6. Xác định hàm lượng đường tổng (TCVN 4594-88)
Nguyên lý:
Chiết đường tổng số từ mẫu bằng nước nóng, dùng acid clohydric thủy phân thành đường glucose, lượng glucose được xác định qua các phản ứng với dung dịch pheling, sắt (III) sunphate và kali pemanganat.
Xử lý mẫu:
Đối với nguyên liệu chứa nhiều tinh bột hay inulin (khoai lang, sắn, khoai tây), trích ly đường bằng rượu 70÷80o. Đun cách thủy hỗn hợp trong bình có lắp ống sinh hàn. Cân 5-20 g mẫu cho vào bình cầu, tráng kỹ cốc cân bằng cồn, lượng cồn cho vào bình khoảng ½ thể tích. Trong trường hợp này khơng cần kết tủa protein vì lượng protein chuyển vào dung dịch khơng đáng kể. Lọc qua giấy lọc gấp nếp, thu dịch lọc vào bình định mức 500 mL, rửa kỹ kết tủa, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ.
Hút 50-100 mL dịch lọc chuyển vào bình cầu 250 mL thêm 15 mL acid clohydric đặc, đun cách thủy có lắp ống sinh hàn trong 15 phút lấy ra để nguội. Trung hòa dung dịch mẫu bằng NaOH 30% thử bằng giấy chỉ thị. Chuyển tồn bộ dịch mẫu vào bình định mức 250 mL, thêm nước cất đến vạch, lắc kỹ.
Hút 10-25 mL dung dịch mẫu vào bình tam giác 250 mL, cho vào bình hỗn hợp gồm 25 mL dung dịch pheling A và 25 mL dung dịch pheling B, lắc nhẹ, đặt trên bếp điện có lưới amiăng và đun 3 phút kể từ lúc sôi. Để nguội bớt và lắng kết tủa đồng oxit. Gạn bỏ lớp nước bên trên và lọc lấy kết tủa, chú ý để lúc nào trên mặt kết tủa cũng có lớp dung dịch hay nước cất. Rửa kỹ kết tủa bằng nước cất nóng, chuyển phễu lọc chứa kết tủa sang bình tam giác khác và hịa tan kết tủa bằng 10-20 mL dung dịch sắt (III) sulphate 5%.
Chuẩn độ lượng sắt (II) hình thành trong bình tam giác bằng dung dịch kali pemanganat 0,1 N cho đến khi dung dịch có mầu hồng sẫm bền vững trong 1 phút. Ghi số mL kalipemanganat 0,1 N đã dùng. Tra bảng Bectrand được số mg glucose tương ứng, Hàm lượng đường tổng X (%): 𝑋2 = 𝑎×𝑉1×𝑉3×100 𝑚×𝑉×𝑉2 a: Số mg glucose tương ứng, g V1: Thể tích bình định mức trích ly đường, 500 mL V3: Thể tích bình định mức sau khi thủy phân, 250 mL m: Khối lượng mẫu, g
V: Thể tích mẫu lấy để thủy phân, mL
V2: Thể tích mẫu lấy để thực hiện phản ứng pheling, mL
7. Xác định hàm lượng tinh bột (TCVN 4594-88)
Hàm lượng tinh bột trong mẫu là hiệu số giữa hàm lượng glucid tổng số và hàm lượng đường tổng số xác định theo phương pháp Bectrand và nhân với hệ số 0,9.
Xác định hàm lượng glucid tổng số:
Cân 5-20 g mẫu, chuyển tồn bộ vào bình cầu 250 mL, tráng kỹ cốc cân bằng nước cất, lượng nước cho vào bình khoảng 100-150 mL. Thêm 25 mL acid clohydric đặc vào bình mẫu, đun cách thủy trên bếp có lắp ống sinh hàn trong 2 giờ. Lấy bình ra làm nguội, trung hòa mẫu bằng NaOH 30%, lọc, định mức 250 mL.
Hút 5-25 mL dịch lọc, chuyển vào bình tam giác dung tích 250 mL, thêm vào bình 50 mL hỗn hợp pheling A, B và tiếp tục đun, lọc, hòa tan và chuẩn độ như hàm lượng đường tổng. Ghi số mL kali pemanganat 0,1 N đã dùng.
Hàm lượng glucid tổng X (%): 𝑋1 = 𝑎×𝑉1×100
𝑚×𝑉 a: Số mg glucose tương ứng, g
Hàm lượng tinh bột X(%):
𝑋 = (𝑋1− 𝑋2) × 0,9
8. Hàm lượng amylose
Hàm lượng amylose được xác định bằng cách đo màu tinh bột tạo phức với iodine theo phương pháp chuẩn của Juliano và cs (1971) nhưng có điều chỉnh. Cân chính xác 2 mg bột sắn dây, thêm vào 20 μL ethanol và 180 μL NaOH 1 N, hồ hóa trong 3 phút. Bổ sung nước cất để được 2 mL, hút 0,2 mL hỗn hợp dịch tinh bột, thêm 40 μL CH3COOH, 80 μL Lugol, 3680 μL nước cất để được 4 mL dung dịch. Cho vào cuvette 4 mL, để ổn định trong 20 phút rồi đo quang ở bước sóng 680 nm. Từ giá trị đo quang thu được dựa vào đường chuẩn amylose xác định được % amylose có trong mẫu.
9. Hàm lượng amylopectin
% amylopectin = 1 - % amylose
10. Hàm lượng ethanol (TCVN 5562-2009, phương pháp dùng bình tỷ trọng)
Nguyên lý: Chưng cất một lượng mẫu đã cân sẵn để tách ethanol ra. Xác định tỷ trọng
của dịch cất bằng bình tỷ trọng. Tra bảng tỷ trọng của hỗn hợp ethanol-nước để xác định hàm lượng ethanol.
Chuẩn bị bình tỷ trọng:
Bình tỷ trọng đã được rửa cẩn thận bằng hỗn hợp sulfocromic, sau đó rửa nhiều lần bằng nước, rồi tráng bằng rượu hỗn hợp rượu-ete. Rửa sạch rồi tráng bằng nước cất, sau đó sấy ở nhiệt độ 70°C đến 80°C trong 1 h đến khi thu được khối lượng không đổi (m1).
Cho nước cất ở 20°C đến đầy bình tỷ trọng và cân (m2).
Tiến hành chưng cất:
Cân 100 g ± 0,1 g mẫu rượu cho vào bình cầu sạch. Thêm khoảng 200 mL nước cất, đồng thời cho khoảng 50 mL nước cất vào bình hứng.
Kiểm tra độ kín của hệ thống chưng cất và lượng nước làm lạnh.
Đun nhẹ bình chưng cất (khơng cho bọt trào qua bầu bảo hiểm). Khi bình chưng cất bắt đầu sơi thì tăng dần nhiệt độ. Nhiệt độ của nước làm lạnh ở đầu ra không vượt quá 25°C. Tiến hành chưng cất với tốc độ đều, cho đến khi thể tích trong bình hứng đạt khoảng 90 mL trong khoảng thời gian 30 phút đến 60 phút. Đặt bình hứng trong hỗn hợp nước đá để làm lạnh.
Kết thúc chưng cất, tráng rửa đầu cuối ống sinh hàn bằng nước cất và thêm nước vào bình hứng cho vừa đủ 100 g.
Nếu khối lượng dịch cất q 100 g thì phải tính hệ số hiệu chỉnh. Giữ dịch cất sau khi cân ở 20°C±0,5°C trong khoảng 30 phút.
Xác định tỷ trọng của dịch cất:
Rót dịch cất vào bình tỷ trọng đã tráng từ 2 lần đến 3 lần bằng dịch cất đã điều chỉnh đến 20°C.Rót nhẹ theo thành bình để tránh tạo thành bọt khí. Rót đầy đến miệng bình, đậy nút bình tỷ trọng. Dùng giấy lọc hoặc vải mềm lau khơ tồn bộ phía ngồi bình. Chỉ cần lau ở cổ bình để tránh làm thay đổi nhiệt độ của dung dịch trong bình, đặt
bình vào buồng cân và cân (m3). Khi cân phải bảo đảm nhiệt độ dung dịch trong bình tỷ trọng ở 20°C±0,5°C.
Tỷ trọng tương đối (d20/20oC) được tính theo cơng thức:
1 2 1 3 20 / 20 m m m m d oC
m1 là khối lượng bình tỷ trọng, tính bằng gam
m2 là khối lượng bình tỷ trọng với nước ở 20°C, tính bằng gam m3 là khối lượng bình tỷ trọng và dịch cất ở 20°C, tính bằng gam
Từ tỷ trọng tương đối ,tra bảng xác định được hàm lượng ethanol tính bằng % khối lượng.
Nếu khối lượng của dịch cất khơng đúng 100 g thì kết quả được nhân với hệ số hiệu chỉnh k tính theo cơng thức sau:
B D m m k
mD là khối lượng của dịch cất, tính bằng gam; mB là khối lượng của mẫu, tính bằng gam.
Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình cộng của 2 lần xác định song song. Chênh lệch kết quả của hai lần xác định song song không vượt quá 0,06 %.
11. Số tế bào nấm men, xác định bằng cách đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu
Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào, nhỏ một giọt lên bề mặt buồng đếm kề với cạnh của lá kính nhờ một pipet. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn.
Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang. Đặt buồng đếm vào bàn kính hiển vi và để yên vài phút.
Trước tiên chỉnh kính hiển vi với vật kính x10 sau khi đã thấy các ơ của buồng đếm chỉnh đến vật kính x40 để có thể thấy rõ ràng các tế bào lẫn các đường kẻ.
Số lượng tế bào trong 1 mL mẫu nghiên cứu: N = [(a/b) x 400/0,1] x 103 x 10n
a: số lượng tế bào nấm men trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ). b: số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn.
400: tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm.
0,1: thể tích dịch tế bào (tính bằng mm3) chứa trên ô trung tâm. 103: số chuyển mm3 thành mL.
10n: độ pha loãng mẫu.
12. Xác định hàm lượng puerarin
Hàm lượng puerarin được xác định theo phương pháp của Zhao et al., 2014)
nhưng có điều chỉnh.
Hàm lượng puerarin trong nguyên liệu: Sử dụng sóng siêu âm để trích ly puerarin trong nguyên liệu (bột sắn dây) theo phương pháp của Wu et al. (2011) dưới điều kiện tối ưu: nồng độ ethanol 71,35%, thời gian trích ly 49,08 phút, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi: 21,72 (mL/g), ở tần số 40 kHz. Mẫu sau khi trích ly được pha lỗng và xác định hàm lượng puerarin.
Hàm lượng puerarin trong dịch thủy phân: dịch đường thu được sau quá trình thủy phân sẽ được lọc qua giấy lọc membrane (0,45 μm), pha loãng và xác định hàm lượng puerarin.
Sử dụng thiết bị HPLC để phân tích hàm lượng puerarin có trong mẫu. Mẫu trước khi bơm vào thiết bị HPLC sẽ được lọc qua đầu lọc Syringe Filter (đường kính 13 mm, kích thước lỗ lọc 0,45 μm). 10 μL dịch được bơm vào thiết bị HPLC (Hitachi, Nhật Bản) với hệ thống bơm tự động. Sử dụng cột sắc ký C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), pha động gồm hỗn hợp methanol:nước (55:45) với tốc độ dịng chảy 0,8 mL/phút và đo ở bước sóng 250 nm để xác định hàm lượng puerarin.
𝑝𝑢𝑒𝑟𝑎𝑟𝑖𝑛 (𝑚𝑔
𝑔 ) =
𝐴 𝑥 𝑉 𝑥 𝑛 𝑔 𝑥 1000
A: Nồng độ puerarin suy ra từ đường chuẩn (μg/mL) V: Thể tích dịch lọc (mL)
n: Độ pha lỗng
g: Khối lượng mẫu (g)