CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.5. Quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose bằng enzyme maltogenic amylase
2.5.2. Quá trình tổng hợp phức puerarin-maltose
Li et al., 2004 đã nghiên cứu khả năng chuyển hóa của enzyme để kiểm tra tính đặc hiệu chấp nhận đối với puerarin. Bốn loại enzyme đã được sử dụng: BSMA (EC 3.2.1.133), T. maritima maltosyl-transferase (TMMT; EC 3.2.1.25), T. scotoductus 4-α- glucanotransferase (TS4αGTase; EC 3.2.1.25) và Bacillus sp. I-5 cyclodextrin glucanotransferase (BSCGTase; EC 3.2.1.19). Để làm sáng tỏ quá trình chuyển hóa, tác giả sử dụng maltotriose làm phân tử chất nhận. Phản ứng được thực hiện với 1% puerarin và 5% maltotriose. Kết quả cho thấy TMMT và TS4αGTase tạo thành rất ít các sản phẩm chuyển hóa của puerarin (Hình 2.13a: giếng 3 và 5) mặc dù các enzyme này đã thủy phân và chuyển hóa maltotriose (Hình 2.13b: giếng 3 và 5). Điều này cho thấy TMMT và TS4αGTase khơng có tính đặc hiệu chấp nhận đối với puerarin do khơng tạo thành liên kết O-glucoside giữa D-glucose và 7-OH-daidzein. Ngược lại, BSMA và BSCGTase tạo thành một lượng lớn các sản phẩm chuyển hóa của puerarin (Hình 2.13a: giếng 2 và 4).
Hình 2.13: Kết quả phân tích TLC của các sản phẩm chuyển hóa giữa puerarin và maltotriose bằng 4 loại enzyme chuyển hóa khác nhau. 1. Puerarin, 2. BSMA, 3. TMMT, 4.
BSCGTase, 5. TS4αGTase
a. Các điểm được quan sát ở bước sóng 254 nm đối với isoflavones b. Các điểm quan sát trong dung dịch 110oC, 10 phút đối với carbohydrate b. Các điểm quan sát trong dung dịch 110oC, 10 phút đối với carbohydrate
(Nguồn: Li et al., 2004)
Kết quả phân tích TLC đã chỉ rõ có ít nhất 8 điểm phân biệt bao gồm 2 điểm chính (dưới điểm puerarin), điều này cho thấy BSMA đã thực hiện phản ứng chuyển hóa một cách tuyệt đối so với các enzyme cịn lại. BSMA ưu tiên chuyển hóa đơn vị maltose được giải phóng từ q trình thủy phân đến phân tử chất nhận bằng cách hình thành liên kết α-(1,6)-glycoside giữa chất cho và chất nhận (Cha et al., 1998). Xét một loạt các sản phẩm chuyển hóa được hình thành trong phản ứng của BSMA, tác giả giả định cả maltose và glucose được tạo ra từ phân tử chất cho đều được chuyển hóa đến phân tử chất nhận bằng cách hình thành liên kết α-(1,3)- hoặc α-(1,6)-glycoside. Cơ chế phản ứng của BSMA với puerarin và maltotriose được thể hiện trong Hình 2.14. Đầu tiên, BSMA tấn công và thủy phân chất cho (maltotriose) để tạo thành phức trung gian giữa cơ chất thủy phân (maltose hoặc glucose) và enzyme. Sau đó, nước hoặc phân tử chất nhận (puerarin hoặc maltooligosaccharide) tấn công phức hợp trung gian trong hỗn hợp phản ứng. Chính vì thế, 3 loại sản phẩm phản ứng do BSMA được hình thành: các sản phẩm của quá trình thủy phân, các sản phẩm maltooligosyl-transglycosylation (Hình 2.13b: giếng 2) và các sản phẩm chuyển hóa puerarin (Hình 2.13a: giếng 2).
Hình 2.14: Cơ chế phản ứng chuyển hóa puerarin bằng Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA)
(Nguồn: Li et al., 2004)
Khi các sản phẩm chuyển hóa của puerarin (maltosyl-α-(1-6)-puerarin, glucosyl- α-(1-6)-puerarin) được tạo thành thì độ hịa tan cải thiện rõ rệt so với puerarin. Kết quả được thể hiện trong Bảng 2.10.
Bảng 2.10: Độ hòa tan của puerarin và các sản phẩm chuyển hóa của puerarin
Isoflavones Độ hịa tan trong nước (mM) Độ hòa tan tương đối
Puerarin 12,45±0,11 1
Glucosyl-α-(1-6)-puerarin 178,59±2,48 14
Maltosyl-α-(1-6)-puerarin 2094,56±21,77 168
(Nguồn: Li et al., 2004)
Khi sử dụng tinh bột hòa tan để làm cơ chất cho q trình chuyển hóa của puerarin, Li et al., 2004 đã đưa ra kết quả: hiệu suất tạo thành các sản phẩm chuyển hóa của
puerarin đạt 40,9% khi sử dụng 0,5% tinh bột, 1% puerarin; trong khi đó hiệu suất đạt 66,6% khi sử dụng 5% maltotriose làm cơ chất dưới cùng điều kiện phản ứng 55°C, 55 phút, nồng độ BSMA 1 U/mg. Khi tăng nồng độ tinh bột đến 5% thì hiệu suất tạo thành các sản phẩm chuyển hóa tăng đến 70%. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ trên 5% thì khơng sử dụng được do độ nhớt của hỗn hợp phản ứng cao. Khi nồng độ tinh bột ít hơn 1% thì maltosyl-α-(1-6)-puerarin tạo thành là chủ yếu, và glucosyl-α-(1-6)-puerarin chiếm ưu
Hình 2.15: Sự thay đổi nồng độ isoflavone theo nồng độ tinh bột trong phản ứng chuyển hóa bằng BSMA (G1: Glucose G2: Maltose)
(Nguồn: Li et al., 2004)