CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.4. Hệ enzyme amylase
Enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside của các polysaccharide với sự tham gia của nước. Enzyme amylase thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrin thành glucose, maltose và dextrin mạch ngắn. Enzyme amylase thuộc enzyme đơn giản. Có 3 loại amylase thường dùng trong chế biến thực phẩm hiện nay: Enzyme α-amylase, β-amylase và glucoamylase (Bảng 2.9). Chúng thủy phân các liên kết glycoside của tinh bột, glycogen và các polysaccharide cùng loại. Enzyme amylase được chia làm 2 nhóm là enzyme nội phân (endoamylase) và ngoại phân (exoamylase).
Hình 2.7: Những enzymes có liên quan đến sự phân cắt tinh bột
(Nguồn: Van der Maarel et al., 2002)
Bảng 2.9: Khả năng chịu nhiệt của amylase
Nguồn gốc Nhiệt độ tối thích (oC) pH tối thích
Malt 72-75 5,3-5,8
Nấm mốc 50-60 5,0-6,0
Vi khuẩn 60-70 6,0-7,0
(Nguồn: Lượng và ctv., 2004)
2.4.1. Enzyme β-amylase (EC 3.2.1.2)
β-amylase được dùng trong q trình thủy phân tinh bột và ứng dụng chính là để sản xuất si rô maltose (Bentley et al., 1996; Shaw et al., 1999). Phần lớn enzyme β-
trong dung dịch tinh bột thuần khiết của β-amylase là 4,6, còn trong dung dịch nấu (không sôi) là 5,6. Nhiệt độ tối thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết là 40 ‒ 50oC, còn trong dung dịch nấu là 60 ‒ 65oC.
Enzyme β-amylase là một loại exoamylase. Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu khơng khử của các nhánh ngồi cùng của cơ chất. Enzyme β-amylase cắt liên kết α-1,4- glycoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glycoside đứng kế cận α-1,6-glycoside thì nó ngưng tác dụng. Phần saccharide cịn lại là dextrin phân tử lớn, có chứa nhiều liên kết α-1,6-glycoside. β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose, khoảng 54 ‒ 58% amylopectin thành maltose. Sản phẩm tạo thành là đường maltose nên β-amylase còn được gọi là enzyme đường hóa.
Nếu tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả α-amylase và β-amylase thì lượng tinh bột sẽ bị thủy phân khoảng 95%. Cả 2 enzyme này đều không cắt được nối α-1,6- glycoside trong phân tử tinh bột. Kết quả tác dụng của α-amylase và β-amylase ta thu được dịch đường gồm 78 ‒ 80% maltose và glucose, 20 ‒22% là dextrin chứa các nối α-1,6-glycoside.
β-amylase còn được ứng dụng trong việc cải thiện khả năng tiêu hóa chậm của tinh bột bắp (Miao et al., 2014a). Kết quả cho thấy rằng khi sử dụng β-amylase để biến tính tinh bột bắp trong 2 giờ thì có sự gia tăng giá trị SDS (slowly digestible starch) từ 11,16 lên 24,38%; hàm lượng amylose tăng từ 28,4 lên 32,5%; số liên kết α-1,6-glycoside tăng từ 7,4 lên 10,1%; khối lượng phân tử giảm từ 32,5.107 xuống còn 3,8.105g/mol.
2.4.2. Enzyme Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA) 2.4.2.1. Tên gọi và nguồn gốc 2.4.2.1. Tên gọi và nguồn gốc
Maltogenic amylase (EC.3.2.1.133) cịn có các tên gọi khác như: 1,4-alpha-D- glucan alpha-maltohydrolase; Maltogenic α-amylase; Glucan 1,4-α-maltohydrolase.
Maltogenic amylase được phân lập từ các vi khuẩn gram dương, sống ở đất gồm có các vi khuẩn thuộc loài Bacillus như: B. stearothermophilus, B. subtilis, B. licheniformi, B. thermoalkalophiluss (Cha et al., 1998; Kim et al., 1999; Bae et al.,
2002; Shim et al., 2002; Kim et al., 2003). Bên cạnh đó, BSMA cịn được phát hiện ở các vi khuẩn chịu nhiệt gram âm thuộc chủng Thermus sp như: Thermus sp. 314,
Thermus sp. 4-1A, Thermus sp. A4, Thermus sp. ATN1, Thermus sp. IM6501, Thermus
sp. TAK16D, Thermus sp. X-1, Thermus sp. Y5, Thermus sp. Z05 (Kim et al., 1999). Ngoài ra, Oh et al. (2005) lần đầu tiên phát hiện BSMA được phân lập từ Lactobacillus
gasseri ATCC 33323.
Maltogenic amylase thuộc phân họ của họ các enzyme thủy phân liên kết glycoside GH13 cùng với các enzyme khác như cyclodextrinase (EC 3.2.1.54), pullulasnase (EC 3.2.1.135) và Thermoactinomyces vulgaris R-47 α – amylase II (Kim
2.4.2.2. Các đặc tính của maltogenic amylase
Maltogenic amylase thể hiện những đặc tính khác so với các loại amylase khác. Maltogenic amylase khơng được tiết ra ngồi tế bào mà là một enzyme liên kết với màng tế bào (Kim et al., 1999; Tang et al., 2006). Maltogenic amylase thể hiện tác động kép lên cơ chất, có khả năng cắt được liên kết α-1,4 và α-1,6 glycoside; chuyển liên kết α- 1,4 thành α-1,6, α-1,3 hoặc α-1,4 khác (Bae et al., 2002). Đặc biệt maltogenic amylase có khả năng thủy phân acarbose, một pseudotetrasaccharide có khả năng ức chế mạnh một số enzyme carbohydrase như các loại bao gồm: α–amylase, α–glucosidase và cyclodextrin glycosyltransferases (CGTase). Hơn nữa, maltogenic amylase không chỉ cắt liên kết glycoside đầu tiên của phân tử acarbose mà còn chuyển acarviosine – glucose (sản phẩm thủy phân) đến các phân tử carbohydrate tiếp nhận.
Maltogenic amylase còn được biết đến như một loại enzyme có thể chuyển các mono và disaccharide đến nhiều loại phân tử tiếp nhận khác nhau (Kim et al.,1999; Bae et al., 2002). Maltogenic amylase hoạt động mạnh trên cơ chất
cyclodextrin (CD) hơn là trên tinh bột hoặc pullulan, enzyme này phân giải cơ chất β- CDs (7 đơn vị glucose) nhanh hơn 100 lần so với tinh bột hoặc pullulan. Ngược lại, các amylase khác với một đặc tính thủy phân khơng thể phân giải CDs hoặc pullulan. Maltogenic amylase cắt liên kết α-1,4 hiệu quả hơn α-1,6, với nồng độ cơ chất thấp sản phẩm tạo thành chủ yếu là maltose vì vậy enzyme này có tên là “maltogenic amylase”. So sánh với CGTases hoạt tính chuyển glycoside của maltogenic amylase yếu hơn nhiều bởi vì maltogenic amylase chủ yếu chuyển cơ chất thành các sản phẩm thủy phân (Cha
et al., 1998; Kim et al., 1999; Bae et al., 2002).
BSMA từ các nguồn khác nhau thì có các điều kiện phản ứng tối ưu khác nhau. Nhìn chung, nhiệt độ tối ưu cho các BSMA hoạt động từ 40 ‒ 60oC. Hiện tại, BSMA chịu nhiệt độ cao nhất được phân lập từ chủng Thermus sp. IM6501 (ThMA), có nhiệt độ hoạt động tối ưu là 60oC (Shim et al., 2002; Kim et al., 2003; Oh et al., 2005).
Hình 2.8: Cơ chế phản ứng của enzyme BSMA
(Nguồn: Lê Quang Trí và ctv., 2008)
Khả năng chịu nhiệt là một trong những đặc tính quan trọng nhất của enzyme sử dụng trong công nghiệp, đặc biệt là các enzyme sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến tinh bột. Vì vậy đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu nhằm tăng khả năng chịu nhiệt của BSMA bằng cách gây biến đổi gen. Kim et al., 2002 đã biến đổi gen của chủng vi khuẩn Thermus sp. IM6501, các chủng vi khuẩn đột biến cho sản phẩm BSMA (ThMA-DM) có khả năng chịu nhiệt lên tới 75oC. ThMa-DM chỉ giảm ½ hoạt tính sau 172 phút ở nhiệt độ 80oC, trong khi đó ở nhiệt độ này enzyme ThMA từ chủng tự nhiên bị mất hoàn toàn hoạt tính trong vịng 1 phút (Kim et al., 1999; Whitehurst & Law,
2002; Tang et al., 2006; ) đã tạo ra loại BSMA chịu nhiệt bằng việc đột biến vi khuẩn
B. thermoalkalophilus ET2 (BTMA). BTMA mới này có nhiệt độ tối ưu là 80oC và mất 85% hoạt tính ở 85oC. Thời gian enzyme bị mất ½ hoạt tính ở 85oC cao hơn gấp 3 lần so với ThMA (Tang et al., 2006) (Hình 2.9).
Hình 2.9: Cấu trúc phân tử của enzyme maltogenic amylase
2.4.2.3 Ứng dụng của enzyme BSMA