Ký hiệu Nhân tố Đơn vị Mức độ
G Nhiệt độ °C Giờ U/g tinh bột 45 55 65 H Thời gian 2 4 6 I Nồng độ 10 15 20
Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken
STT Nhiệt độ (0C) Thời gian (giờ) Nồng độ (U/g tinh bột)
1 45 2 15 2 45 6 15 3 45 4 10 4 45 4 20 5 65 2 15 6 65 6 15 7 65 4 10 8 65 4 20 9 55 2 10 10 55 2 20 11 55 6 10 12 55 6 20 13 55 4 15 14 55 4 15 15 55 4 15 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ BSMA đến q trình biến tính hợp chất puerarin
Tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm được tiến hành tương tự thí nghiệm 4.
Sau khi xác định được giá trị pH thích hợp ở thí nghiệm 4, cho dung dịch đệm natri citrate theo tỷ lệ (1:1) vào nhằm mục đích cố định giá trị pH nhất định đồng thời tăng khả năng hoạt động cho enzyme BSMA. Trong quá trình thủy phân, bổ sung 10% maltodextrin để tăng hoạt tính của enzyme BSMA.
Thí nghiệm được tiến hành với 45 đơn vị thí nghiệm (Bảng 3.6) theo mơ hình Box- Behnken.
Vơ hoạt enzyme BSMA trước khi bổ sung enzyme γ-amylase với nồng độ 60U/g tinh bột trong thời gian 60 phút.
Tiếp tục vơ hoạt enzyme γ-amylase, sau đó lọc và xác định hàm lượng puerarin có trong dịch đường sau thủy phân.
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng puerarin (mg/g)
Nội dung 3: Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa có bổ sung phức chất puerarin-maltose
3.3.2.7. Thí nghiệm 6: Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của giống
Saccharomyces oviformis trong môi trường nước dứa – sắn dây ở giai đoạn nhân
sinh khối a. Mục đích
Nhằm xác định khả năng phát triển của nấm men Saccharomyces oviformis trong môi trường nước dứa-sắn dây. Đồng thời qua khảo sát có thể xác định được thời gian nhân giống thích hợp cũng như số lượng tế bào nấm men cần thiết để đưa vào lên men.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 2 nhân tố khảo sát (Hình 3.8). Nhân tố J: tỷ lệ nước dứa-sắn dây, thay đổi ở 5 mức độ
J1: 2:8 J2: 4:6 J3: 5:5 J4: 6:4 J5: 8:2 Nhân tố H: thời gian nhân giống, thay đổi ở 3 mức độ
K1: 24h K2: 48h K3: 72h
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm sự sinh trưởng và phát triển của giống nấm men S. oviformis theo thời gian
Tiến hành thí nghiệm:
Nước sắn dây sau khi được thủy phân bằng enzyme β-amylase và BSMA sẽ được bổ sung nước dứa với các tỷ lệ thay đổi ở 5 mức độ và tiến hành lọc, điều chỉnh các giá trị thích hợp cho quá trình nhân giống:
pH 4,5-5,5 Pepton: 1% Bx: 15
Sau khi đã cân bằng dinh dưỡng như trên, tiến hành tiệt trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 30 phút và làm nguội đến nhiệt độ phòng. Dùng que cấy giống nấm men
S. oviformis từ ống thạch nghiêng vào bình tam giác 500 mL chứa môi trường trên. Tiến
hành nhân giống ở nhiệt độ 28-32oC trong máy lắc ổn nhiệt.
Trong quá trình nhân giống, cứ sau 24 giờ lấy mẫu 1 lần kiểm tra số lượng tế bào nấm men trong 1 mL dịch nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi: số lượng tế bào nấm men/mL dịch nuôi cấy theo thời gian. Xác
3.3.2.8. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phối chế nước dứa- nước sắn dây đến giá trị cảm quan của sản phẩm
a. Mục đích
Xác định được tỷ lệ phối chế thích hợp để tạo sản phẩm có nồng độ cồn thích hợp cũng như có giá trị cảm quan cao.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 1 nhân tố khảo sát, các nhân tố cịn lại được cố định. Chọn thơng số tối ưu và tiếp tục thay đổi các nhân tố cịn lại (Hình 3.9).
Hình 3.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ phối chế nước dứa-sắn dây Nhân tố L: tỷ lệ phối chế nước dứa-sắn dây, thay đổi ở 5 mức độ:
L1: 2:8 L2: 4:6
L3: 5:5 L4: 6:4
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 3 = 15.
Tiến hành thí nghiệm:
Dịch sắn dây sau giai đoạn thủy phân bằng enzyme β-amylase và BSMA sẽ được đem đi gia nhiệt ở 100oC trong 15 phút để dừng các phản ứng thủy phân bởi các enzyme trên đồng thời tiêu diệt các vi sinh vật gây hại có thể ảnh hưởng đến q trình lên men.
Sau khi gia nhiệt, dịch sắn dây được để nguội đến nhiệt độ phòng và tiến hành phối chế với nước dứa ứng với các tỷ lệ khảo sát sao cho thể tích cuối đạt được là 500 mL. Bổ sung dịch nấm men đã được nuôi cấy với thời gian thích hợp trong mơi trường dịch dứa-sắn dây (thí nghiệm 5) ở tỷ lệ 10%. Điều chỉnh Brix, pH với các giá trị tương ứng 20, 4,5 và tiến hành lên men ở nhiệt độ thường.
Cứ sau 1 ngày ghi nhận kết quả 1 lần, đến khi đạt độ cồn mong muốn (5-6o) thì dừng quá trình lên men.
Chỉ tiêu theo dõi:
Đánh giá cảm quan sản phẩm.
3.3.2.9. Thí nghiệm 8: Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa-sắn dây (khảo sát ảnh hưởng của pH, Bx, tỷ lệ nấm men) trong điều kiện lên men ở nhiệt độ thường
a. Mục đích
Tìm ra được các thơng số tối ưu cho nấm men phát triển giúp thu được hàm lượng cồn thích hợp nhất cũng như chất lượng cảm quan của sản phẩm là tốt nhất.
b. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 nhân tố khảo sát (pH, Brix, tỷ lệ nấm men), các nhân tố còn lại được cố định.
Hình 3.10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến quá trình lên men
Mức độ của các nhân tố được thể hiện ở Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm được thực hiện theo mơ hình Box-Behnken với 3 nhân tố, 3 mức độ (Bảng 3.8).
Thí nghiệm được thực hiện 2 lần Tống số đơn vị thí nghiệm: 30 Bảng 3.7: Các nhân tố và mức độ khảo sát
Ký hiệu Nhân tố Đơn vị Mức độ
M pH
%
3,5 4,5 5,5
N Bx 20 22 24
Bảng 3.8: Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken STT pH Bx Tỷ lệ nấm men (%) STT pH Bx Tỷ lệ nấm men (%) 1 3,5 20 10 2 3,5 24 10 3 3,5 22 5 4 3,5 22 15 5 4,5 20 5 6 4,5 20 15 7 4,5 22 10 8 4,5 22 10 9 4,5 22 10 10 4,5 24 5 11 4,5 24 15 12 5,5 20 10 13 5,5 24 10 14 5,5 22 5 15 5,5 22 15 Tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm được tiến hành tương tự thí nghiệm 6. Nước dứa-sắn dây sau khi tìm được các điều kiện thích hợp về tỷ lệ phối chế cũng như khảo sát q trình ni cấy nấm men trong mơi trường nước dứa-sắn dây, sẽ được tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men (pH, Brix, tỷ lệ nấm men) với các mức độ khảo sát được trình bày trong Bảng 3.7.
Thí nghiệm được tiến hành với 30 đơn vị thí nghiệm theo mơ hình Box – Behnken (Bảng 3.8).
Chỉ tiêu theo dõi:
Hàm lượng cồn sinh ra theo thời gian
Sự thay đổi tổng số tế bào nấm men trong dịch lên men Đánh giá cảm quan sản phẩm.
Đánh giá chất lượng sản phẩm nước uống lên men từ sắn dây và dứa
Xác định hàm lượng puerarin trong sản phẩm nước uống lên men. Phân tích các chỉ tiêu của sản phẩm nước uống lên men (theo TCVN). Đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm nước uống lên men.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thành phần hóa học của nguyên liệu sắn dây
Nguyên liệu sắn dây tươi sau khi mua về được gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát mỏng và sấy khô đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 70°C (Zhao et al., 2014). Sắn dây sau khi sấy khô được nghiền thành bột và tiến hành xác định các chỉ tiêu phân tích (Hình 4.1). Kết quả được thể hiện trong Bảng 4.1.
a b
c d
Hình 4.1: Nguyên liệu sắn dây
a-Nguyên liệu tươi; b-Sắn dây cắt lát; c-Sắn dây sau khi sấy khô; d-Sắn dây sau khi nghiền thành bột
Bảng 4.1: Kết quả phân tích thành phần hóa học cơ bản của bột sắn dây
STT Chỉ tiêu Phương pháp Kết quả
1 Độ ẩm AOAC 934.06 6,5%
2 Hàm lượng đường tổng TCVN 4594-88 10,77%
3 Hàm lượng tinh bột TCVN 4594-88 56,46%
4 Hàm lượng amylose TCVN 5716 30,19%
5 Hàm lượng amylopectin TCVN 5716 69,81%
Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy nguyên liệu sắn dây tươi mặc dù có độ ẩm tương đối cao (52,15%), tuy nhiên sau khi sấy khô và nghiền thành bột thì độ ẩm chỉ cịn lại 6,5%. Kết quả này có khác so với các nghiên cứu trước đây, độ ẩm bột sắn dây theo Nguyen Van Dao et al. (2009) là khoảng 5%, còn theo Wu et al. (2012) thì độ ẩm bột sắn dây thích hợp cho q trình trích ly isoflavone bằng phương pháp sóng siêu âm là 8,65%. Tùy theo mục đích của q trình sử dụng mà độ ẩm nguyên liệu ban đầu có khác nhau.
hàm lượng tinh bột của sắn dây Pueraria lobata được trồng tại tỉnh Thanh Hóa có hàm lượng tinh bột tổng 99,46% (Hung & Morita, 2007) và bột sắn dây được cung cấp bởi công ty Geye Starch (Anhui, China) 96,92% (Guo et al., 2016). Còn theo Xia et al.
(2012), hàm lượng tinh bột tương ứng với hai loại sắn dây Pueraria lobata và Pueraria
thomsonii là 85,3 và 87,9%. Sự khác biệt này có thể giải thích là do thành phần hóa học
và cấu trúc tinh bột khác nhau tùy thuộc vào từng giống, điều kiện phát triển và phương pháp phân tích (Kirakosyan et al., 2003). Tinh bột được phân tách từ các loài sắn dây khác nhau sẽ thể hiện các tính chất khác nhau như tính chất lý hóa (hàm lượng amylose, khả năng trương nở, độ hịa tan,...), tính chất hình thái học, cấu trúc tinh thể, tính chất nhiệt (Du et al., 2002; Pham Van Hung & Morita, 2007). Thêm vào đó, Pham Van Hung & Morita (2007) đã đưa ra kết luận cấu trúc tinh thể của 3 loại tinh bột sắn dây từ Việt Nam, Nhật Bản và Hàn Quốc có sự khác nhau là do môi trường sinh trưởng khác nhau. Tuy nhiên, đây vẫn là nguyên liệu có hàm lượng tinh bột khá cao, thích hợp là cơ chất cho q trình thủy phân bằng enzyme để chuyển hóa tinh bột thành đường khử phục vụ các quá trình chế biến tiếp theo.
Thành phần chính của tinh bột là amylose và amylopectin. Kết quả từ Bảng 4.1 cho thấy hàm lượng amylose trong bột sắn dây khá cao (30,19%) khi so sánh với các loại tinh bột khác: khoai tây (21,01%), khoai lang (22,7%), củ sen (20,29%) (Guo et al., 2016). Kết quả này cũng cao hơn nhiều so với bột sắn dây được cung cấp từ công ty Geye, Trung Quốc (23,6%) (Guo et al., 2016) và sắn dây được trồng tại Thanh Hóa, Việt Nam (22,2%) (Pham Van Hung & Morita, 2007). Theo báo cáo của Suzuki et al. (1981), hàm lượng amylose trong bột sắn dây khoảng 20,8-21% trong khi đó, Soni & Agarwal (1983) đã chỉ ra rằng hàm lượng amylose trong bột sắn dây ít hơn 15,1%. Xia
et al. (2012) đã tiến hành xác định các đặc tính hóa lý, điểm kết tinh và tính chất nhiệt
của hai lồi sắn dây Pueraria lobata (Willd.) Ohwi và Pueraria thomsonii Benth. Hàm lượng amylose trong hai loại sắn dây được xác định lần lượt là 20,1% và 24,7% tương ứng với các loài Pueraria lobata (Willd.) Ohwi và Pueraria thomsonii Benth. Reddy et
al. (2017) so sánh hàm lượng amylose trong các loại tinh bột bao gồm đậu đỏ và sắn
dây. Kết quả cho thấy hàm lượng amylose trong đậu đỏ là 19.18% trong khi đó hàm lượng tinh bột sắn dây là 23.34%. Liu et al. (2020) tiến hành so sánh cấu trúc và tính chất lý hóa của tinh bột từ đậu đỏ và đậu dolichos. Kết quả cho thấy đậu đỏ có hàm lượng amylose thấp hơn (26,64%) so với đậu dolichos (31,85%). Hàm lượng amylose trong bột sắn dây ở nghiên cứu này và các nghiên cứu khác có sự khác biệt là do đặc tính ngun liệu cũng như q trình chăm sóc và canh tác các loại cây trồng. Hung & Morita (2007) cũng đã chỉ ra rằng sự khác nhau của các kết quả về hàm lượng amylose có thể phụ thuộc vào giống cây trồng và điều kiện sinh trưởng của chúng.
Puerarin là hợp chất chiếm tỷ lệ cao nhất trong isoflavones của sắn dây bên cạnh daidzin, daidzein, genistin và genistein. Tuy nhiên, puerarin lại ít hịa tan trong nước nhưng tan trong các dung mơi hữu cơ (ethanol, aceton), trong đó độ hịa tan của puerarin trong ethanol là cao nhất khi so sánh với nước và aceton (Wang & Cheng, 2005). Chính
vì thế để xác định hàm lượng puerarin trong nguyên liệu, ethanol được sử dụng làm dung mơi trích ly với sự hỗ trợ của sóng siêu âm theo phương pháp tối ưu của Wu et al. (2012).
Hình 4.2: Đồ thị đường chuẩn puerarin khi chạy HPLC
Đồ thị đường chuẩn sử dụng để định lượng puerarin được thể hiện trong Hình 4.2. Kết quả phân tích HPLC cho thấy hàm lượng puerarin có trong sắn dây (Pueraria
thomsonii) chiếm 0,96% (9,6 mg/g) (Hình 4.3). Kết quả này hồn tồn phù hợp với các
tài liệu ghi nhận được, hàm lượng puerarin trong Pueraria lobata khơng ít hơn 2,6% (HKCMMS, 2010), trong khi đó puerarin của Pueraria thomsonii nằm trong khoảng từ 0,3 đến 2,6% (PPRC, 2000, 2010). Theo Wong et al. (2015), khi so sánh hàm lượng puerarin có trong 2 lồi Pueraria lobata và Pueraria thomsonii, kết quả này một lần nữa
khẳng định puerarin trong P. lobata (6,069%) cao hơn rất nhiều so với P. thomsonii
(0,508%). Kết quả này cũng cao hơn khi so sánh với lồi sắn dây Pueraria thomsonii nhưng được trích ly bằng methanol với sự hỗ trợ của vi sóng (0,586%) (Liu et al., 2011). Chen et al. (2016) tiến hành xác định thành phần hóa học của Pueraria thomsonii Benth khi sử dụng các phương pháp xử lý nhiệt khác nhau. Kết quả cho thấy hàm lượng flavonoid (mg CAE/g) trong sắn dây nguyên liệu trồng tại Trung Quốc được xác định là 0,3%. Điều này có thể được giải thích một phần bởi Aguilera et al. (2011) khi các tác giả này cho rằng có sự phân giải các dẫn xuất isoflavone thành các dạng tự do khác nhau tùy theo các loài cây họ đậu và phương pháp chế biến nhiệt. Zhang et al. (2008) phát hiện ra rằng sắn dây từ các khu vực khác nhau của Trung Quốc có hàm lượng puerarin dao động từ 0,01 đến 1,00% (10 mg/g ở dạng thô). Kết quả hiện tại phù hợp với nghiên cứu trước đó, trong khi Zeng et al. (2012) cho rằng hàm lượng puerarin của sắn dây ăn được phát hiện là 4,07 mg/g khi sử dụng HPLC. Ngoài ra, nghiên cứu trên chỉ ra rằng quá trình luộc và hấp làm tăng hàm lượng isoflavone của sắn dây từ 0,77 mg/g (trong sắn dây thô) lên 2,12 mg/g (trong sắn dây luộc) và 1,03 mg/g (trong sắn dây hấp).
Hình 4.3: Bản sắc ký đồ phân tích puerarin bằng HPLC
a. Puerarin trong mẫu chuẩn (thời gian lưu 3,2 phút), b. Puerarin trong nguyên liệu (thời gian lưu 3,22 phút)
4.2. Tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase enzyme β-amylase
4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
Các mẫu bột sắn dây được chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau 8, 10, 12, 14 và 16%, được hồ hóa ở 90°C trong thời gian 30 phút, được hạ nhiệt xuống 60°C, bổ sung enzyme β-amylase ở nồng độ 20 U/g tinh bột và tiến hành thủy phân trong 2 giờ. Kết quả xác định hàm lượng đường khử được thể hiện trong Bảng 4.2.
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hàm lượng đường khử
Mẫu Nồng độ cơ chất (%) Đường khử (mg/g)
1 8 119,56±6,4c 2 10 141,68±4,44d 3 12 116,99±7,86bc 4 14 108,04±3,98b 5 16 94,79±4,89a Tỷ số F 27,4 Giá trị P 0,0000
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%)
Kết quả Bảng 4.2 cho thấy khi nồng độ cơ chất tăng hàm lượng đường khử tạo ra trong dịch thủy phân cũng thay đổi. Hàm lượng đường khử tạo ra cao nhất (141,68 mg/g) ứng với nồng độ cơ chất 10% và thấp nhất (94,79 mg/g) ở nồng độ 16%. Các mẫu bột sắn dây ở các nồng độ 8, 10, 12 và 14% tạo ra lượng đường khử có sự khác biệt ý nghĩa so với mẫu ở nồng độ 16%. Khi nồng độ cơ chất tăng từ 8 lên 10%, hàm lượng đường khử tạo ra cũng tăng theo, tuy nhiên sau đó, hàm lượng đường khử tạo ra lại giảm xuống