CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.2. Tối ưu hó aq trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
enzyme β-amylase
4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase
Các mẫu bột sắn dây được chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau 8, 10, 12, 14 và 16%, được hồ hóa ở 90°C trong thời gian 30 phút, được hạ nhiệt xuống 60°C, bổ sung enzyme β-amylase ở nồng độ 20 U/g tinh bột và tiến hành thủy phân trong 2 giờ. Kết quả xác định hàm lượng đường khử được thể hiện trong Bảng 4.2.
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hàm lượng đường khử
Mẫu Nồng độ cơ chất (%) Đường khử (mg/g)
1 8 119,56±6,4c 2 10 141,68±4,44d 3 12 116,99±7,86bc 4 14 108,04±3,98b 5 16 94,79±4,89a Tỷ số F 27,4 Giá trị P 0,0000
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%)
Kết quả Bảng 4.2 cho thấy khi nồng độ cơ chất tăng hàm lượng đường khử tạo ra trong dịch thủy phân cũng thay đổi. Hàm lượng đường khử tạo ra cao nhất (141,68 mg/g) ứng với nồng độ cơ chất 10% và thấp nhất (94,79 mg/g) ở nồng độ 16%. Các mẫu bột sắn dây ở các nồng độ 8, 10, 12 và 14% tạo ra lượng đường khử có sự khác biệt ý nghĩa so với mẫu ở nồng độ 16%. Khi nồng độ cơ chất tăng từ 8 lên 10%, hàm lượng đường khử tạo ra cũng tăng theo, tuy nhiên sau đó, hàm lượng đường khử tạo ra lại giảm xuống
khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất đến 16%. Siew Ling Hii et al. (2012) cho thấy q trình thủy phân có thể thực hiện ở nồng độ cơ chất cao hơn (30 đến 40%) so với quy trình bình thường (25 đến 30%) nếu sử dụng sự kết hợp của enzyme khử phân nhánh và β-amylase. Mặt khác, Das & Kayastha (2018) sử dụng một loại enzyme β-amylase mới từ đậu phộng (Arachis hypogaea) để tiến hành thủy phân tinh bột. Kết quả cho thấy nồng độ cơ chất quá cao có thể ức chế một phần quá trình thủy phân tinh bột do hiện tượng β-amylolysis (ức chế cơ chất) cùng với sự biến tính của enzyme do tiếp xúc lâu dài ở 50°C, trong giai đoạn sau của quá trình thủy phân. Tương tự với kết luận trên, Melnichuk
et al. (2020) tiến hành thủy phân vỏ đậu nành và bột mì bằng phương pháp lên men sử
dụng xúc tác là enzyme α-amylase từ nấm Aspergillus oryzae. Kết quả cho thấy khi sử dụng vỏ đậu nành/bột mì ở tỷ lệ là 9/11, hoạt tính xúc tác của enzyme đạt hiệu quả tốt nhất và không đổi khi tăng tỷ lệ cơ chất sử dụng. Tuy nhiên, hoạt tính enzyme giảm được ghi nhận khi tăng nồng độ cơ chất sử dụng do hiện tượng ức chế cơ chất và mức độ hồ hóa của dung dịch hồ tinh bột lớn.
Nồng độ cơ chất là một trong những thông số quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng bởi enzyme. Ở mức nồng độ thấp (8%), hiệu suất thủy phân không cao dẫn đến hàm lượng đường khử tạo thành thấp. Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng tăng, kết quả hàm lượng đường khử của tinh bột sau thủy phân tăng. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng khơng tăng mà có chiều hướng giảm do hàm lượng chất khơ hòa tan cao làm tăng độ nhớt, ngăn cản enzyme tiếp xúc với cơ chất. Khi ứng dụng enzyme để cải thiện khả năng tiêu hóa chậm của tinh bột bắp, Miao
et al., 2014 cũng chọn nồng độ tinh bột 10% để thực hiện q trình biến tính bằng
enzyme β-amylase và BSMA. Có lẽ đây là nồng độ thích hợp cho việc thủy phân tinh bột bằng enzyme. Trên cơ sở đó, nồng độ cơ chất 10% được chọn làm thơng số cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.2. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây dưới tác dụng của enzyme β-amylase dụng của enzyme β-amylase
Enzyme chỉ có thể hoạt động tốt nhất ở trạng thái nhất định khi mà vận tốc xúc tác của phản ứng enzyme mạnh nhất. Trong quá trình thuỷ phân tinh bột, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào sự hình thành liên kết enzyme – tinh bột. Liên kết này do sự hấp thụ lẫn nhau giữa các nhóm háo nước có trên bề mặt của các hạt tinh bột và enzyme như [- COOH], [- OH], [- COO], [NH2], [- SH]. Các nhóm này khi tác dụng với nhau sẽ làm giảm năng lượng bề mặt, làm biến dạng các phần riêng biệt của phân tử amylose và amylopectin, dẫn đến làm đứt các liên kết glucoside để tạo sản phẩm và giải phóng enzyme. Trạng thái này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH môi trường, các ion kim loại, các hợp chất vô cơ và hữu cơ,… (Hoàng Kim Anh và ctv., 2003; Lê Ngọc Tú và ctv., 2002).
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng đường khử tạo thành STT pH Hàm lượng đường khử (mg/g) STT pH Hàm lượng đường khử (mg/g) 1 5 131,33±3,01b 2 5,5 149,24±5,88b 3 6 160,01±1,86c 4 6,5 137,74±5,81b 5 7 104,76±10,54a
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%)
Kết quả từ Bảng 4.3 cho thấy khi pH tăng thì hàm lượng đường khử tạo thành cũng tăng, trong đó mẫu ở pH 6 có hàm lượng đường khử cao nhất (160,01 mg/g). Kết quả thống kê cho thấy tất cả các mẫu đều có sự khác biệt ý nghĩa so với mẫu pH 6. Khi tiếp tục tăng giá trị pH đến 7 thì hàm lượng đường khử lại có chiều hướng giảm.
Khi điều chỉnh pH của dung dịch tinh bột ở khoảng pH trung tính (pH 7) thì có sự giảm hàm lượng đường khử tạo ra. Từ kết quả phân tích có thể thấy hoạt tính enzyme β-amylase thể hiện tốt nhất ở khoảng giá trị pH từ 5 đến 6 và đạt cao nhất ở pH 6. Có thể đây là giá trị pH thích hợp cho enzyme hoạt động.
pH trong mơi trường phản ứng có khả năng tác động lên trạng thái tích điện của nhóm carboxyl hoặc nhóm amin qua đó làm thay đổi các mối liên kết ion (vốn có chức năng tạo cấu hình khơng gian cho phân tử protein), chính vì vậy sẽ làm thay đổi cấu hình khơng gian của phân tử enzyme. Tại pH tối ưu, cấu hình khơng gian của enzyme hoặc trạng thái tích điện của cơ chất là phù hợp cho phản ứng xảy ra nhất. Ngoài pH tối ưu, khả năng xúc tác của enzyme yếu hơn hoặc bị bất hoạt (Lê Ngọc Tú và ctv., 1997; Hoàng Kim Anh và ctv., 2005; Shih et al., 2007). Theo kết quả phân tích, khi tăng giá trị pH hàm lượng đường khử tạo thành thay đổi không nhiều, kết quả thống kê cho thấy ở nhiều mẫu sự khác biệt này là khơng đáng kể. Hay nói cách khác với khoảng pH từ 5- 6,5 hoạt tính enzyme tương đối ổn định.
Kết quả này cũng gần tương đồng với kết quả của các nghiên cứu khác. Femi-Ola
et al. (2013) đã khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính β-amylase từ Bacillus subtilis
với khoảng pH thay đổi từ 3 đến 8. Kết quả hoạt tính β-amylase cao nhất ở giá trị pH 5. Kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Federico Battista & David Bolzonella
(2018) khi cho rằng hầu hết β-amylase đều có pH tối thích trong khoảng pH acid từ 4,5- 6,2. Theo nghiên cứu của Obineme et al. (2003) thì pH tối thích cho β-amylase từ Aspergillus niger là 5, kết quả tương tự cho β-amylase từ Volvariella volvacea (Olaniyi et al., 2010). Sarowar et al. (2009) cho rằng pH tối thích cho β-amylase từ rễ Raphanus sativus là 6. Sự khác nhau này có thể là do nguồn gốc của enzyme hay mỗi enzyme chỉ
Kết quả phân tích thống kê cho thấy mẫu thủy phân ở giá trị pH 5,5 có lượng đường khử tạo ra là 149,24 mg/g khác biệt khơng có ý nghĩa so với mẫu ở pH 6 có lượng đường khử tạo ra là 160,01 mg/g.
4.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme β-amylase đến quá trình thủy phân tinh bột sắn dây quá trình thủy phân tinh bột sắn dây
Hiệu quả thủy phân tinh bột của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đặc biệt là nhiệt độ, nồng độ sử dụng và thời gian thủy phân (Kunamneni & Singh, 2005). Trong sản xuất, việc xác định được thời gian thủy phân hợp lý có ý nghĩa quan trọng về mặt kỹ thuật.
Mẫu bột sắn dây 10%, pH 6 được đem đi hồ hóa trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 90oC, sau khi hồ hóa, dịch hồ tinh bột được hạ nhiệt độ xuống 60 oC, thực hiện q trình đường hóa với việc bổ sung enzyme β-amylase.
(a)
(b)
Hình 4.4: Tinh bột sắn dây sau khi hồ hóa (a) và thủy phân (b)
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 nhân tố khảo sát (nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme), các nhân tố còn lại được cố định. Phương pháp bề mặt đáp ứng theo mơ hình Box-Behnken được sử dụng để xác định các thơng số tối ưu (Bảng 4.4).
Bảng 4.4: Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken và kết quả hàm lượng đường khử tạo thành theo thực nghiệm và theo mơ hình
STT Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) Nồng độ (U/g tinh bột) Hàm lượng đường khử (mg/g) (theo thực nghiệm) Hàm lượng đường khử (mg/g) (theo mơ hình) 1 45 2 40 *134,29±1,43 133,53 2 45 6 40 137,51±0,79 137,14 3 45 4 20 124,97±2,81 125,42 4 45 4 60 123,40±0,92 124,08 5 65 2 40 127,14±1,64 127,56 6 65 6 40 130,46±2,21 131,17 7 65 4 20 112,63±1,16 111,96 8 65 4 60 126,04±2,28 125,59 9 55 2 20 128,07±0,71 128,35 10 55 2 60 138,65±3,68 138,71 11 55 6 20 136,23±1,63 136,18 12 55 6 60 138,38±1,62 138,11 13 55 4 40 160,05±2,18 159,91 14 55 4 40 159,57±1,17 159,91 15 55 4 40 160,11±1,27 159,91
*: giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm
Hiệu quả thủy phân tinh bột của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đặc biệt là nhiệt độ, nồng độ sử dụng và thời gian thủy phân (Annor et al. 2017). Li et al. (2016) đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện thủy phân bao gồm nồng độ enzyme, pH, nhiệt độ và tốc độ khuấy đến quá trình thủy phân chất thải nhà bếp để sản xuất xanthan bằng enzyme. Nồng độ đường khử được theo dõi theo thời gian trong suốt quá trình thực hiện cho đến khi đạt giá trị không đổi. Shokrkar et al. (2017) cũng tiến hành khảo sát các yếu tố nhiệt độ, nồng độ enzyme α-amylase, pH và thời gian thủy phân cho quá trình chiết xuất đường từ hỗn hợp nuôi cấy vi tảo bằng phương pháp thủy phân enzyme. Kết quả chỉ ra rằng hàm lượng đường khử tối đa đạt được là 96,3% bằng cách thêm các enzyme theo thứ tự là enzyme cellulase ở 50 ºC với pH 4,5; sau đó bổ sung enzyme α-amylase ở 70 ºC và pH 6 với nồng độ cơ chất là 50 g/L.
Tối ưu hóa q trình thủy phân trong nghiên cứu này được thực hiện bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, các nghiệm thức được bố trí theo mơ hình Box-Behnken. Ba yếu tố được lựa chọn cho quá trình là nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme. Hàm lượng đường khử sinh ra được dùng để đánh giá hiệu quả của quá trình thủy phân. Kết quả được thể hiện ở Bảng 4.5.
Bảng 4.5: Kết quả phân tích thống kê ANOVA cho hàm lượng đường khử Mã hóa Tổng bình Mã hóa Tổng bình phương Độ tự do Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị p Model 8482,19 9 942,465 288,72 0,0000 X1: nhiệt độ (0C) 214,421 1 214,421 82,96 0,0001
X2: thời gian (giờ) 78,1974 1 78,1974 30,25 0,0015
X3: nồng độ enzyme (U/g) 226,544 1 226,544 87,65 0,0001 X1X1 4685,43 1 4685,43 1812,79 0,0000 X1X2 0,00811133 1 0,00811133 0,00 0,9571 X1X3 168,089 1 168,089 65,03 0,0002 X2X2 541,46 1 541,46 209,49 0,0000 X2X3 53,2249 1 53,2249 20,59 0,0039 X3X3 3423,98 1 3423,98 1324,74 0,0000 Block 12,4515 2 6,22573 2,41 0,1706 Residual 114,25 35 3,26429 Lack-of-fit 86,2908 27 3,19596 1,24 0,4278 Pure error 15,5079 6 2,58465 Total (corr.) 8596,44 44 R2 0,988 Adj R2 0,985
Từ các số liệu thu thập được, mơ hình tương quan giữa hàm lượng đường khử tạo thành và các nhân tố khảo sát (nhiệt độ, thời gian, nồng độ) đã được xây dựng và được thể hiện ở phương trình (1). Kết quả phân tích thống kê ANOVA (Bảng 4.5) cho thấy mơ hình tương quan có ý nghĩa thống kê cao, giá trị cho hệ số R2 = 0,988. Ý nghĩa của mỗi hệ số được xác định thông qua kiểm định F và giá trị p. Đối với bất kỳ một điều kiện nào của mơ hình thì giá trị F lớn và giá trị p nhỏ sẽ chỉ ra một tác động đáng kể đối với các biến đáp ứng tương ứng. Kết quả Bảng 4.5 đã cho thấy giá trị F và p của mơ hình lần lượt là 288,72 và 0,0000, điều đó có nghĩa là mơ hình đã được chấp nhận. Y = - 520,813 + 21,5708X1 + 16,9202X2 + 2,8513X3 – 0,205667X12 + 0,00129995X1X2 + 0,0187132X1X3 – 1,74789X22 – 0,052651X2X3 – 0,0439538X32 (1)
Trong đó: Y: đường khử (mg/g), X1 (oC): nhiệt độ thủy phân, X2 (giờ): thời gian thủy phân, X3 (U/g bột): nồng độ enzyme
Các hệ số trong mơ hình bao gồm hệ số bậc một, hệ số bậc hai, hệ số tương tác đều có ý nghĩa (p<0,05), trong đó hệ số tương tác giữa 2 nhân tố nhiệt độ và thời gian khơng có ý nghĩa (p = 0,9571 > 0,05), do đó hệ số này có thể được lược bỏ nhằm rút gọn phương trình, phương trình (1) trở thành:
Y = - 521,099 + 21,576X1 + 2,8513X3 + 16,9917X2 – 0,205667X12 – 0,0439538X32 – 1,74789X22 + 0,0187132X1X3 – 0,052651X2X3 (2)
y = 0,9989 x + 0,1478 (3)
Mức độ phù hợp của mơ hình cũng đã được đánh giá thơng qua giá trị F của Lack of fit. Mơ hình tương quan tốt cần sự phù hợp giữa giá trị thực tế và lý thuyết, vì vậy mơ hình thu được với kiểm định Lack of fit (kiểm định sự khơng phù hợp) khơng có ý nghĩa thống kê là điều mong muốn (Zabeti et al., 2009). Dữ liệu thu được từ Bảng phân tích thống kê (Bảng 4.5) cho thấy giá trị p = 0,4278>0,05 của Lack of fit khơng có ý nghĩa thống kê nên khả năng phù hợp của mơ hình là rất cao.
Hình 4.5: Biểu đồ sự tương thích giữa hàm lượng đường khử theo thực nghiệm và theo mơ hình
Để xem xét sự tương tác của các nhân tố ảnh hưởng, các đồ thị 3 chiều của mơ hình hồi quy khơng tuyến tính đã được biểu diễn trong Hình 4.6. Hình biểu diễn cho thấy cả ba nhân tố (nhiệt độ, thời gian, nồng độ enzyme) cũng như sự tương tác của các cặp nhân tố (nhiệt độ-thời gian, thời gian-nồng độ, nhiệt độ-nồng độ) đều có ảnh hưởng đến hàm lượng đường khử tạo thành.
Phương trình (2) cho thấy khi tăng nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme, hàm lượng đường khử tạo ra cũng tăng theo. Trong đó, hệ số tuyến tính của X1 (21,576)>X2 (16,9917) >X3 (2,8513). Điều này chứng tỏ nhiệt độ và thời gian là 2 nhân tố có ảnh hưởng đến lượng đường khử tạo thành nhiều hơn nồng độ enzyme.
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Trong các phản ứng sinh học, khi nhiệt độ tăng, khả năng xúc tác của enzyme sẽ tăng. Tuy nhiên, do bản chất enzyme là protein khơng bền nhiệt nên tốc độ phản ứng có một giới hạn nhất định, quá giới hạn đó tốc độ phản ứng sẽ giảm (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2004). Tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme, loại cơ chất, pH mơi trường… mà nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme có thể thay đổi. Kết quả Bảng 4.5 và Hình 4.6-A, Hình 4.6-C cũng cho thấy hàm lượng đường khử tăng khi nhiệt độ thủy phân tăng từ 45 lên 55°C, nhưng khi tiếp tục tăng nhiệt độ đến 65°C thì hàm lượng đường khử lại giảm. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với lý thuyết, khi tăng nhiệt độ làm cho động năng của enzyme và cơ chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều hơn. Các phức chất emzyme-cơ chất hình thành nhiều hơn, phản ứng xảy ra nhanh hơn. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao, enzyme
bị biến tính. Khi cấu hình trung tâm hoạt động của enzyme khơng cịn phù hợp với cơ chất, enzyme mất hoạt tính xúc tác. Khi nhiệt độ hạ thấp hơn nhiệt độ tối ưu, cơ chất và phân tử enzyme chuyển động chậm. Tần số va chạm giữa chúng thấp, kết quả là ít phức hợp enzyme-cơ chất được hình thành và tốc độ phản ứng sẽ giảm. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước đây. Năm 1974, Shinke et al. đã cho rằng nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính của β-amylase từ Streptomyces sp. là 50°C đến 60°C. Trong khi β-amylase từ Curculigo pilosa có nhiệt độ tối thích 55°C (Dicko et al., 1999). Sự biến