STT pH Hàm lượng puerarin (mg/g) 1 4,5 6,84±0,22b 2 5 7,75±0,16c 3 5,5 7,10±0,22b 4 6 6,31±0,29a 5 6,5 6,31±0,27a
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%)
Kết quả thống kê cho thấy khi pH thay đổi từ 4,5 đến 6,5 thì hàm lượng puerarin tổng hợp được cũng thay đổi theo. Ở các giá trị pH 4,5; 5 và 5,5 hàm lượng puerarin tổng hợp được có khác biệt ý nghĩa so với pH 6 và 6,5, trong đó hàm lượng puerarin của mẫu ứng với giá trị pH 5 là cao nhất (7,75 mg/g) và khác biệt có ý nghĩa so với hàm lượng puerarin của các mẫu còn lại. Kết quả này cho thấy hoạt tính của BSMA thể hiện rõ ở khoảng pH acid yếu (từ 4,5 đến 5,5) và cao nhất ở pH 5. Có thể đây là giá trị pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác của enzyme BSMA. Ở pH tối ưu, vận tốc phản ứng xảy ra nhanh nhất, BSMA thể hiện hoạt tính chuyển hóa tốt nhất.
Maltogenic amylase thể hiện tác động kép lên cơ chất, có khả năng cắt liên kết α- 1,4 và α-1,6 glycoside; chuyển liên kết α-1,4 thành α-1,6, α-1,3 hoặc α-1,4 khác. Hơn nữa, maltogenic amylase không chỉ cắt liên kết glycoside đầu tiên của phân tử acarbose mà còn chuyển acarviosine-glucose (sản phẩm thủy phân) đến các phân tử carbohydrate tiếp nhận (Sihui Pa et al., 2019). Bacillus stearothermophilus maltogenic α-amylase
(BSMA) có tác dụng cắt chuỗi bên của amylopectin có thể kết tinh, do đó hạn chế sự tái kết tinh của amylopectin và sự hình thành mạng lưới trong quá trình bảo quản (Seung- Hye Woo et al, 2020). BSMA thủy phân cyclomaltoheptaose, pullulan, tinh bột,
acarbose và thể hiện hoạt tính chuyển hóa, chuyển maltose và glucose đến phân tử chất nhận bằng cách tạo liên kết α-(1,4) và α-(1,6)-glycoside (Baek et al., 2003). Cụ thể trong nghiên cứu này, BSMA chuyển các gốc đường glucose, maltose đến phân tử chất nhận (puerarin) để tạo thành các sản phẩm chuyển hóa của puerarin, qua đó làm tăng độ hịa tan của puerarin. Ngồi giá trị pH tối ưu thì hoạt tính của enzyme giảm, kết quả dẫn tới hàm lượng puerarin tổng hợp được cũng giảm theo.
enzyme (Hình 4.7). Độ pH ban đầu làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất, phức hợp enzyme-cơ chất. Tại pH tối ưu, cấu hình khơng gian của enzyme hoặc trạng thái tích điện của cơ chất là phù hợp cho phản ứng xảy ra nhất. Ngoài pH tối ưu thì khả năng xúc tác của enzyme yếu hơn hoặc bị bất hoạt (Lê Ngọc Tú và ctv., 2002; Hoàng Kim Anh và ctv., 2005; Shih et al., 2007). pH quá cao hoặc quá thấp sẽ làm ảnh hưởng đến điện tích cũng như khả năng tích điện của enzyme và cơ chất, làm giảm hoặc mất khả năng kết hợp với cơ chất của enzyme. Do đó, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm hoặc bị mất (Zhiwen Cao et al. 2019).
Hình 4.7: Cấu trúc 3D của phân tử protein
(Nguồn: Marks et al., 2011)
Nhiều tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp amylase của vi sinh vật và có những cơng bố rất khác nhau. Prajapati (2014) đã công bố pH tối ưu để B.amyloliquefaciens KCP2 sinh tổng hợp amylase cao là 8,0.
Trong khi đó, kết quả từ nghiên cứu của Nguyễn Thế Trang và ctv., (2012) cho thấy, chủng Geobacillus sp. LP09 có hoạt tính α-amylase tốt nhất trong khoảng pH từ 6,5 ‒ 7,5. Ở pH 7 hoạt tính α-amylase cao nhất đạt 14,6 UI/mL. Ở pH 6 hoạt tính α-amylase thấp nhất chỉ đạt 13,2 UI/mL, trong khi đó ở pH 8 hoạt tính chỉ đạt 13,6 UI/mL.
Từ các phân tích trên, giá trị pH 5 được chọn là thơng số thích hợp cho q trình biến tính hợp chất puerarin dưới tác dụng của enzyme BSMA.
4.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA đến q trình biến tính hợp chất puerarin trình biến tính hợp chất puerarin
Tối ưu hóa q trình biến tính hợp chất puerarin được thực hiện bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, các nghiệm thức được bố trí theo mơ hình Box-Behnken. Ba yếu tố được lựa chọn cho quá trình là nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA. Hàm lượng puerarin tổng hợp được sau q trình biến tính được dùng để đánh giá hiệu quả của quá trình chuyển hóa (Hình 4.8).
Hình 4.8: Dịch sắn dây sau khi ủ enzyme và lọc
Kết quả hàm lượng puerarin tính tốn theo mơ hình và hàm lượng đo cụ thể được thể hiện ở Bảng 4.7. Bảng 4.8 trình bày kết quả phân tích thống kê ANOVA cho việc tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng của enzyme BSMA.
Bảng 4.7: Sự thay đổi hàm lượng puerarin (mg/g) dưới ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme BSMA STT Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) Nồng độ (U/g tinh bột) Hàm lượng puerarin (theo thực nghiệm) Hàm lượng puerarin (theo mơ hình) 1 45 2 15 7,1067±0,0167 7,1122 2 45 6 15 7,1184±0,0340 7,1253 3 45 4 10 7,1192±0,0198 7,0855 4 45 4 20 7,1241±0,0257 7,1452 5 65 2 15 7,2483±0,0250 7,2242 6 65 6 15 7,2258±0,0308 7,2373 7 65 4 10 7,1829±0,0249 7,1975 8 65 4 20 7,2592±0,0042 7,2572 9 55 2 10 7,1004±0,0685 7,1191 10 55 2 20 7,0563±0,0192 7,0560 11 55 6 10 7,0091±0,0333 7,0094 12 55 6 20 7,2107±0,0562 7,1919 13 55 4 15 7,4782±0,0119 7,4840 14 55 4 15 7,4976±0,0433 7,4840 15 55 4 15 7,4762±0,0265 7,4840
*: giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm
Việc thăm dị và tối ưu hóa một bề mặt đáp ứng có thể tạo ra những kết quả không mong muốn, trừ khi mơ hình đó thể hiện sự phù hợp tốt thơng qua việc kiểm định sự phù hợp của mơ hình (Liyana-Pathirana et al., 2005). Hệ số R2 được dùng để kiểm định mức độ phù hợp của mơ hình (Nath et al., 2007) và giá trị này lớn hơn 0,90 thể hiện mức độ phù hợp cao (Haaland et al., 1989). Giá trị R2 nhỏ thể hiện sự tương tác kém