Các máy móc, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm hiện có tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Phòng Thí nghiệm chuyên sâu, Trường Đại học Cần Thơ. Một số thiết bị, dụng cụ chính dùng để phân lập và định danh vi khuẩn Azospirillum được liệt kê chi tiết dưới đây:
Tủ cấy vi sinh vật (Pháp).
Tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức). Kính hiển vi Olympus CHT (Nhật Bản). Kính hiển vi Olympus BH-2 (Nhật Bản).
Kính hiển vi điện tử quét JBS 5500 (Nhật Bản). Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức). pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ).
Cân điện tử Sartorius (Đức).
Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan). Tủ sấy EHRET (Đức).
Tủ lạnh -20oC Electrolux Confor Plus (Thụy Điển). Tủ lạnh -4oCAkira (Việt Nam).
Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức). Máy khuấy từ (Hoa Kỳ).
Máy chụp ảnh kỹ thuật số Sony P200 (Nhật Bản).
Máy tính Sony Vaio dùng để phân tích và lưu trữ số liệu (Hoa Kỳ). Máy PCR Perkin Elmer PE 9700 (Hoa Kỳ).
Hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ). Máy đo nồng độ ADN vi khuẩn Beckman DU-600 (Đức). Máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417C (Đức).
Máy ly tâm chân không Concentrator 5301 (Đức). Máy ủ cách thủy GFL 1083 (Đức).
Máy đo diệp lục tố SPAD (Hoa Kỳ). Ống nghiệm 15mL (Đức).
50 Đĩa petri đường kính 6cm, 10cm (Đức). Bộ điện di một chiều Embi-Tec (Hoa Kỳ).
Bộ micropipet Bio-Rad P10, P20, P200, P1000 (Hoa Kỳ). Bộ micropipet Gibson P10, P20, P200, P1000 (Đức).
Các loại ống tuýp (eppendorf) 1,5 mL và 2,0 mL dùng trích mẫu ADN, các loại tuýp nhỏ dùng cho phản ứng PCR.
Một số dụng cụ thí nghiệm khác như: Kính lúp, que cấy, lam, lam men, que thủy tinh, bi thủy tinh, kẹp, dao cắt mẫu, kéo cắt mẫu, cối nghiền mẫu, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, găng tay, xô trộn phân sinh học, chậu trồng cây,…
3.1.2Vật liệu thí nghiệm
Lúa cao sản và lúa hoang được thu hoạch tại các ruộng lúa của 11 huyện, thị, thành phố trong toàn tỉnh An Giang như: An Phú, Châu Đốc, Châu Phú, Châu Thành, Chợ Mới, Long Xuyên, Phú Tân, Tân Châu, Tịnh Biên, Tri Tôn và Thoại Sơn.
Giống lúa cao sản: OM 6976 và OM 4218 (Hình 3.1). Sử dụng hai dòng vi khuẩn Azospirillum đối chứng dương là Azospirillum brasilense và
Azospirillum lipoferum do Trường Đại học Florence, Ý cung cấp.
A B
C D
Chú thích: Lúa hoang (A), các dạng bông lúa hoang (B), các hạt lúa hoang có đuôi dài từ 3-7 cm (C) và lúa cao sản OM 4218 (D).
51
Sử dụng hai cặp mồi (primers) chuyên biệt do Tập đoàn Bioneer, Hàn Quốc sản xuất và cung cấp để định danh các dòng vi khuẩn đã được phân lập. Cặp mồi I: Dùng định danh loài vi khuẩn Azospirillum brasilense: Mồi xuôi (Forward primer): 5’-AGTAACCTCCCATGTCTTTG-3’ và Mồi ngược (Reverse primer): 5’-ACGAAGTGGATGAGCTGGG-3’. Cặp mồi II: Dùng định danh loài vi khuẩn Azospirillum lipoferum: Mồi xuôi (Forward primer): 5’-GTAAATCCACCACCTCCC-3’ và Mồi ngược (Reverse primer): 5’- TGTAGATTTCCTGGGCCT-3’.
3.1.3Hóa chất thí nghiệm
Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn Azospirillum, xác định đặc tính hình thái, Gram, trích ly ADN vi khuẩn, phản ứng PCR, điện di gel và chụp hình gel chứa sản phẩm PCR của Azospirillum được liệt kê chi tiết dưới đây:
NaCl, KOH, CaCl2, H3BO3, CuSO4, K2HPO4, MnSO4.H2O, FeCl3.6H2O, ZnSO4.7H2O, MgSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, Biotin (vitamin H), agarose 1,8%, pyridoxyl-HCl, DL-malic acid, ethanol (cồn) 80%, dung dịch H2O2 (oxy già) 8%, dung dịch chuẩn pH, dung dịch tween 20 (tỉ lệ 1:20), nước cất hai lần vô trùng, dung dịch FeEDTA 1,64% và Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2 N. Iod, fushin, crystal violet, ethanol (cồn) 70% và nước cất hai lần vô trùng.
TE pH8, SDS 10%, Isopropanol, ethanol (cồn) 70%, CTAB 10%/NaCl 0,7 M, proteinaseK (20 mg/mL), nước cất hai lần vô trùng, chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1), dung dịch TTE (1% Triton X-100, 1M Tris HCl- 8,5, 0,5 M EDTA-8,0) và nước cất vô trùng.
PCR buffer, Taq polymerase, ADN vi khuẩn đã phân lập, nước cất hai lần vô trùng, dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Dùng hai cặp mồi (primers) I và II để nhận diện hai loài vi khuẩn Azospirillum brasilense và Azospirillum lipoferum. Agarose 1,2%, TBE buffer 1X, loading buffer, thang chuẩn PstI
và Ethidium bromide (EtBr).
3.1.4Địa điểm thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ; trong nhà lưới và ruộng lúa tại ấp Vĩnh Bình, xã Vĩnh Thạnh Trung, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang.
52
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa cao sản và lúa hoang
Các mẫu lúa cao sản và lúa hoang được thu hoạch ở các ruộng lúa tại các huyện, thị, thành phố trong tỉnh An Giang (Hình 3.2). Các mẫu lúa này được thu hoạch khi cây lúa đang ở giai đoạn tăng trưởng tối đa (lúc lúa đang trổ bông), thu toàn bộ cây, cắt gọn lá, rửa sạch rễ và đánh số mã hóa và chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập.
Chú thích: Địa điểm thu mẫu lúa cao sản và lúa hoang được đánh dấu vòng tròn màu đỏ trên bản đồ.
Nguồn: http://www.angiang.gov.vn
Hình 3.2: Bản đồ các địa điểm thu mẫu lúa cao sản và lúa hoang tại các huyện, thị, thành phố trong tỉnh An Giang.
3.2.1.1 Môi trường nuôi vi khuẩn Azospirillum
Sau khi tách vi khuẩn từ cây lúa cao sản và lúa hoang, tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường NFb (Kirchhof et al., 1997).
Mỗi lít môi trường NFb gồm các thành phần như sau: D(L)-Malic acid C4H6O5 (5,0g), K2HPO4 (0,5g), MgSO4.7H2O (0,2g), NaCl (0,1g), CaCl2 (0,02g), KOH (4,5g), FeEDTA 1,64% (4mL), Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2 N (2mL), Dung dịch vitamin (1mL) và dung dịch nguyên tố vi lượng (2mL).Trong đó, mỗi 100 mL dung dịch vitamin gồm các thành phần như sau: 10 mg biotin (vitamin H), 20 mg pyridoxol-HCl và thêm nước cất hai lần vô trùng cho đủ 100 mL. Mỗi 1 lít dung dịch nguyên tố vi lượng gồm có các thành phần như sau: 0,4g CuSO4; 0,12g ZnSO4.7 H2O; 1,4g H3PO3; 1,5g
O O O O O O O O O O O
53
MnSO4.H2O; 1,0g Na2MoO4.2H2O và thêm nước cất hai lần vô trùng cho đủ 1 lít. Điều chỉnh pH của môi trường NFb về pH = 6,8 rồi thêm 1,8 g/L agar vào để tạo thành môi trường bán đặc và 18 g/L agar vào để tạo thành môi trường đặc. Sau đó khử trùng môi trường NFb bằng phương pháp nhiệt ướt ở 121oC, áp suất 1 Kg/cm2 trong 15 phút.
3.2.1.2 Phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa cao sản trồng và lúa hoang
Sau khi khử trùng các mẫu lúa hoang và lúa cao sản thì tiến hành phân lập vi khuẩn Azospirillum từ thân và rễ lúa. Các dòng vi khuẩn Azospirillum
sau khi được phân lập ròng thì được đặt tên và ký hiệu như sau: AzoHT, AzoHR, AzoT, AzoR, AzoCT, AzoCR,... (Hình 3.4 và Hình 3.5).
Phân lập vi khuẩn Azospirillum từ thân, rễ lúa hoang và lúa cao sản được thực hiện lần lượt theo các bước sau:
- Rửa thật sạch đất bám ở thân và rễ, sau đó tách rời thân và rễ.
- Lấy lớp vỏ ngoài của phần thân ra, rửa phần thân bằng nước, tiếp tục rửa bằng nước cất vô trùng, sau đó cắt thân (hay rễ) thành những đoạn nhỏ 2 – 3 cm rồi làm khô chúng bằng giấy hút ẩm.
- Rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng.
- Tiếp tục khử trùng thân (hay rễ) bằng dung dịch clorox 30% (trong 10 phút), cồn 80% (trong 5 phút), dung dịch H2O2 8% (trong 3 phút) và rửa lại 6 lần bằng nước cất vô trùng.
- Sau khi khử trùng thân (hay rễ) xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem nghiền mịn trong cối cùng với 1mL nước cất vô trùng.
- Lấy 10µL dung dịch nghiền ở trên cấy vào ống nghiệm chứa môi trường NFb bán đặc không bổ sung đạm, sau đó ủ ở 30oC trong tủ ủ Incucell 111 (Đức) để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
- Sau khoảng 1-3 ngày nuôi, khi thấy môi trường nuôi vi khuẩn xuất hiện một lớp màng mỏng trắng đục (pellicle) cách mặt môi trường bán đặc khoảng 0,5-1,5 cm, lấy 5-10µL dung dịch nuôi vùng này cấy sang đĩa petri chứa môi trường NFb đặc rồi tiếp tục đem ủ trong tủ ủ ở 30oC để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
- Tiếp tục theo dõi thường xuyên sự tăng trưởng của vi khuẩn và phân lập nhiều lần để tách ròng vi khuẩn.
- Trữ vi khuẩn đã phân lập ròng trong môi trường NFb có bổ sung đạm (1g KNO3/L) để định danh chúng bằng kỹ thuật PCR.
54
Nguồn: Stoltzfus et al. (1997).
Hình 3.3: Quy trình phân lập vi khuẩn Azospirillum từ cây lúa.
Các bước phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa cao sản trồng và lúa hoang được thực hiện theo các bước sau đây:
Lúa cao sản (lúa hoang) ↓ Rửa sạch ↓ Tách vỏ (thân) ↓ Rửa nước cất khử trùng (3 lần) ↓ Cắt nhỏ 2-3 cm ↓ Rửa nước cất khử trùng (3 lần) ↓ Khử trùng [Clorox 30% (10 phút), cồn 80% (5 phút) và H2O2 8% (3 phút)] ↓ Rửa nước cất khử trùng (6 lần) ↓
Nghiền mịn trong 1mL nước cất khử trùng ↓
Cấy 10-20µL dịch trích vào ống nghiệm (chứa môi trường NFb bán đặc, không đạm)
↓
Ủ 30oC (1-3 ngày) ↓
Cây lúa Khử trùng thân và rễ Nghiền mẫu
Cấy vào môi trường NFb bán đặc
Cấy chuyển sang môi trường NFb đặc
Phân lập và tách ròng
55
Cấy chuyển 5-10µL vào đĩa petri (chứa môi trường NFb đặc, không đạm)
↓ Tách ròng
↓
Trữ mẫu và danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Hình 3.4: Các bước phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa cao sản và lúa hoang.
3.2.2Xác định đặc tính hình thái và định danh vi khuẩn Azospirillum
bằng kỹ thuật sinh học phân tử
3.2.2.1 Đặc tính hình thái và chuyển động của vi khuẩn Azospirillum
Sau khi phân lập và tách ròng các dòng vi khuẩn Azospirillum, tiếp tục quan sát hình dạng tế bào, khả năng chuyển động của chúng trong môi trường nước cất vô trùng. Các mẫu vi khuẩn sống được làm bằng phương pháp giọt ép rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần.
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:
- Nhỏ 5µL nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trãi đều lên giọt nước trên kính mang vật.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
- Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần để thấy được các hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
3.2.2.2 Xác định kích thước tế bào vi khuẩn Azospirillum
Sau khi quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng, tiếp tục xác định kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần.
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:
- Nhỏ 10µL nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trãi đều lên giọt nước trên kính mang vật.
56
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
Để đo kích thước vi khuẩn ta dùng thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính như sau:
- Thước trắc vi thị kính là một miếng kính tròn trên đó chia thành 100 vạch, nó được đặt giữa hai thấu kính của thị kính.
- Thước trắc vi vật kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài 10m.
Phương pháp đo kích thước vi khuẩn như sau:
- Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ ảnh của thước.
- Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho hai thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ hai nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.
- Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính.
- Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau:
m n
N
x *10
x: Trị số 1 khoảng cách của thước trắc vi thị kính N: Số khoảng cách của thước trắc vi vật kính, N = 6 n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n = 35
Ta có: m x *10 35 6
- Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu.
- Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo.
57
- Tính kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của hai thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2002).
3.2.2.3 Xác định Gram của vi khuẩn Azospirillum
Sau khi quan sát và xác định kích thước các tế bào vi khuẩn, tiến hành nhuộm Gram các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập được để xác định xem chúng thuộc Gram âm (G-) hay Gram dương (G+).
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:
- Lấy 10 µL nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trãi mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
- Nhỏ từ một đến hai giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trãi đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
- Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch iod rồi trãi đều bằng que cấy và để trong 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.
- Nhỏ từ một đến hai giọt fushin rồi trãi đều bằng que cấy sau đó để 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
- Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crystal violet là Gram dương (G+), có màu hồng đỏ của fushin là Gram âm (G-).
3.2.2.4 Định danh các dòng vi khuẩn Azospirillum
Các đặc tính về hình dạng, khả năng chuyển động, kích thước và Gram của các dòng vi khuẩn đã phân lập giống như vi khuẩn Azospirillum mà Hall
58
và Krieg (1983), Krieg và Döbereiner (1984), Okon và Labandera-Gonzalez (1994), Bashan et al. (2004) đã mô tả. Vì vậy, những dòng vi khuẩn này được tiếp tục nhận diện và định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) để xác định chúng thuộc loài Azospirillum nào.
a) Trình tự các chu kỳ của phản ứng PCR
Căn cứ trên chuỗi trình tự gen nifH của ADN của vi khuẩn Azospirillum
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html), hai cặp mồi (primers) chuyên biệt được thiết kế để định danh các dòng vi khuẩn Azospirillum có trình tự như sau:
- Cặp mồi I (mồi xuôi: 5’-AGTAACCTCCCATGTCTTTG-3’ và mồi ngược: 5’-ACGAAGTGGATGAGCTGGG-3’).
- Cặp mồi II (mồi xuôi: 5’-GTAAATCCACCACCTCCC-3’ và mồi ngược: 5’-TGTAGATTTCCTGGGCCT-3’.
Sau khi đo nồng độ ADN của các dòng vi khuẩn đã phân lập ròng ở hai độ dài sóng 260 nm và 280 nm, tiến hành chạy phản ứng PCR bằng máy PCR Perkin Elmer PE 9700 (Hoa Kỳ) để nhận diện các dòng vi khuẩn với hai cặp mồi chuyên biệt nêu trên.
Thành phần cho một phản ứng PCR (25µL) gồm: 1,0 µL ADN vi khuẩn;