Vi khuẩn Azospirillum có khả năng tổng hợp các hormone tăng trưởng cho thực vật khi sống cộng sinh với cây trồng như IAA (Indol-3-acetic acid), gibberllin, cytokinin, ethylene và NAA (Naphthaleneacetic acid) (Bashan và Holguin, 1997a, 1997b). Các hormone tăng trưởng thực vật do vi khuẩn tổng hợp ra có thể giúp gia tăng tốc độ tăng trưởng và cải thiện sản lượng của cây trồng (Glick, 1995). Các hormone được vi khuẩn tổng hợp nói chung và IAA nói riêng đã được đề xuất có hiệu quả và mang lại lợi ích cho các loài vi khuẩn trong giống Azospirillum khi sống cộng sinh với cây trồng.
Nút bít cao su Chai B (Chai tạo thành) Nút bít cao su Chai A (Bình chứa phản ứng) Mẫu nước Hệ thống chưng cất Ethylene (C2H4)
Ống điều tiết [Hg(ClO4)2]
LiCl Van khóa
Bơm chân không
Ar + O2 + C2 H C2H4 trong Hg(ClO4)2 Hg
31
a) Đặc tính tổng hợp IAA
Khi chủng A. brasilense vào lúa mì cho thấy vi khuẩn tổng hợp IAA cho lúa mì và làm độ dài của rễ bên tăng lên rõ rệt so với các loại lúa mì hoang dã (Barbieri et al., 1986). Hiệu quả khi chủng Azospirillum ở lúa mì cho thấy rễ trụ của lúa mì kéo dài hơn (Kolb và Martin, 1985) và trên rễ nhánh có nhiều lông hút dinh dưỡng hơn so với không chủng vi khuẩn (Jain và Patriquin, 1985), điều này lý giải là do tác dụng của IAA lên cây trồng mà vi khuẩn tổng hợp được. Tuy nhiên, trong một số trường hợp việc áp dụng hormone tổng hợp không cho thấy các hiệu ứng gây ra bởi vi khuẩn Azospirillum (Yahalom et al., 1990). Ví dụ: Gibberellin GA3 do A. lipoferum tổng hợp khi sống cộng sinh với cây trồng đã có hiệu quả trong việc thúc đẩy tăng trưởng bộ rễ của cây trồng, đặc biệt là tăng mật độ rễ của cây (Piccoli và Bottini, 1994).
Tuy nhiên, khi không bổ sung Tryptophan vào môi trường nuôi thì quá trình tổng hợp IAA của vi khuẩn sẽ bị hạn chế (Prinsen et al., 1993). Khi phân tích tổng hợp IAA đã xác định được khả năng tổng hợp IAA ở loài vi khuẩn A. brasilense (Bar và Okon, 1993). Enzyme xúc tác quá trình tổng hợp IAA trong vi khuẩn là tryptophan-2-monooxygenase (TMO), enzyme này tham gia hoạt động trong hầu hết quá trình tổng hợp IAA cho cây trồng (Patten và Glick 1996). Enzyme TMO cũng được tìm thấy ở loài vi khuẩn Pseudomonas syringae có mối tương quan di truyền tương đối gần với loài A. brasilense.
Về sự hiện diện của con đường Tryptamine trong quá trình tổng hợp IAA của vi khuẩn giống Azospirillum, Hartmann et al. (1983) nhận thấy rằng ở loài vi khuẩn A. brasilense Cd chứ không phải ở loài A. lipoferum có khả năng chuyển đổi Tryptamine để tổng hợp thành IAA khi vi khuẩn phát triển trên các môi trường nuôi cấy chứa hàm lượng dinh dưỡng tối thiểu (Hình 2.13).
Nhiều bằng chứng nghiên cứu đã kết luận sự hiện diện của acid indole3- pyruvic (IPyA) trong quá trình sinh trưởng của A. brasilense đã được trình bày bởi Costacurta et al. (1994), các gen mã hóa cho cho enzyme indole-3- pyruvate decarboxylase (IPDC) được phân lập và tìm thấy ở loài A. brasilense, đây là một trong những enzyme quan trọng trong lộ trình IPyA. Khi phân tích trình tự protein cho thấy có sự tương đồng với IPDC được phân lập từ loài
Enterobacter cloacae. Hơn nữa, hoạt động của các enzyme IPDC có thể được phát hiện trong các chất chiết xuất từ tế bào của loài vi khuẩn A. brasilense và
32
Nguồn: Holguin et al. (1999).
Chú thích: A: Chu trình chuyển hóa tryptophan, B: Indole-3-pyruvate decarboxylase, C: Indole-3- Acetaldehyde oxidase, D: Tryptophan hydrolase, E: Indoleacetamide hydrolase, F: Tryptophan decarboxylase và G: Amin oxidase. Giai đoạn indole-3-pyruvic acid (enzyme A, B và C); giai đoạn indole-3-acetamide (enzyme D và E) và giai đoạn tryptamine (enzyme C, F và G).
Hình 2.13: Sự hình thành IAA từ Tryptophan thông qua vi khuẩn Azospirillum. Sự khác nhau giữa các chuỗi acid amin trên IPDC của A. brasilense 245 (Costacurta et al., 1994; Zimmer et al., 1995), enzyme IPDC của Azospirillum
có một đặc trưng là chất nền khác với IPDC từ các vi sinh vật khác và có thể có một số chức năng sinh lý bổ sung. Khả năng sản xuất IAA là không giới hạn ở thực vật thúc đẩy vi khuẩn tăng trưởng, vi khuẩn tổng hợp IAA có thể có chức năng khác ngoài việc thúc đẩy tăng trưởng cho cây trồng (Zimmer et al., 1995). Các gen ipdC trong loài vi khuẩn A. brasilense đã được biết đến là có chức năng tổng hợp IAA nhưng không phải là tryptophan (Dosselaere et al., 1997).
Khi phân tích khả năng tổng hợp IAA của 12 dòng vi khuẩn thuộc giống
Azospirillum. Kết quả phân tích cho thấy tất cả 12 dòng vi khuẩn này đều có khả năng tổng hợp ra lượng IAA. Đường chuẩn đo lượng đạm có nồng độ NH4+ dao động từ 0-80 (µL/mL). Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn
Azospirillum nhìn chung quá trình tổng hợp đạt một lượng ít ở ngày nuôi cấy thứ 2, quá trình tổng hợp đạt cao nhất vào ngày nuôi cấy thứ 4 và bắt đầu giảm dần vào ngày nuôi cấy thứ 6. Ở ngày nuôi cấy thứ 2, dòng A1 và A3 tổng hợp IAA cao hơn so với các dòng Azospirillum còn lại với lượng IAA lần lượt là 13,843 µg/mL và 11,156 µg/mL. Đến ngày nuôi cấy thứ 4, lượng IAA tăng ở mức cao nhất lần lượt là 17,748 µg/mL và 16,778 µg/mL. Vào ngày nuôi cấy thứ 6, lượng IAA có khuynh hướng giảm nhẹ do dinh dưỡng trong môi trường nuôi cạn dần. So sánh với kết quả nghiên cứu của Bùi Việt Sang (2008) dòng vi khuẩn Azospirillumlipoferum R8b2 cũng tổng hợp được lượng IAA cao nhất
33
vào ngày nuôi cấy thứ 4 là 11,8 µg/mL và Dương Thị Kim Loan (2009) khi đo lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ ruộng lúa thì nhận thấy dòng OM8c1 là 15,358 µg/mL thì các dòng vi khuẩn này đạt hàm lượng IAA cao hơn. Như vậy, dòng A1 và A3 có khả năng tổng hợp IAA cao nhất vào ngày nuôi cấy thứ 4 trong số các dòng vi khuẩn Azospirillum sp. được khảo sát (Bảng 2.16) (Đỗ Kim Nhung và Vũ Thành Công, 2011).
Để xác định vai trò của IAA trong sự tương tác giữa vi khuẩn
Azospirillum với thực vật, có một giả thuyết đặt ra là vi khuẩn hoàn toàn không tổng hợp hoặc tổng hợp lượng IAA không cao (Vande Brock và Vanderleyden, 1995). Điều này thì đúng cho các phytohormones khác. Ví dụ, thí nghiệm với một gen tổng hợp ipdC:gusA cho thấy trong giai đoạn nuôi cấy, các loài vi khuẩn A. brasilense chứa gen ipdC là thể hiện rất cao khi vi khuẩn được sống trong môi trường giàu dinh dưỡng. Tuy nhiên, khi vi khuẩn sống trong môi trường dinh dưỡng tối thiểu và cạn kiệt dần thì quá trình tổng hợp IAA sẽ rất thấp. Kết quả này cho thấy sự khác biệt trong các con đường sinh tổng hợp IAA được nâng lên theo tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn (Dosselaere et al., 1997).
Bảng 2.16: Hàm lượng IAA do vi khuẩn Azospirillum sp. tổng hợp.
Hàm lượng IAA (µg/mL) Vi Khuẩn
Ngày nuôi cấy thứ 2 Ngày nuôi cấy thứ 4 Ngày nuôi cấy thứ 6 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A40 A48 A25 A38 A27 A33 13,843a 8,619cd 11,156b 6,256e 9,788bc 10,634b 5,672e 7,052de 7,284de 6,424e 6,532e 5,922e 17,748a 13,942bc 16,778a 11,778e 15,186b 13,495cd 12,486cde 11,996de 13,327cde 13,327cde 11,935de 12,394cde 15,634a 12,723b 16,405a 10,858c 12,922b 15,373a 7,163c 3,191d 6,354c 6,780c 6,297c 5,163cd CV (%) 12,28 % 6,22 % 13,69 %
Chú thích: Trong cùng một cột các giá trị trung bình theo sau có cùng mẫu tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%. Nguồn: Đỗ Kim Nhung và Vũ Thành Công, (2011).
b) Đặc tính tổng hợp Tryptophan
Các enzyme đầu tiên trong sinh tổng hợp của L-TRP (TrpL) là anthranilate synthase để chuyển đổi hợp chất chorismate vào anthranilate (Hình 2.14). Bằng cách lai tạo ADN và phân tích trình tự ADN (De Troch et al., 1996) cho thấy rằng trong loài vi khuẩn A. brasilense, enzyme anthranilate synthase dường như là một protein dung hợp gồm hai thành phần mã hoá bởi
34
các gen trpE và trpG. Gen trpE mã hóa cho tiểu đơn vị của enzyme anthranilate synthase, trong khi gen mã trpG cho một enzyme glutamine amidotransferase để chuyển ammoniac từ glutamic để vào chorismate. Các gen trpE(G) nằm phía trước trên một chuỗi ADN để mã hóa một chuyển đổi của trpL với một cấu trúc ARN. Vì không tìm thấy cơ chế kiểm soát bổ sung, điều này chỉ ra rằng các gen trpE(G) là gen Trp quy định thông qua sự suy giảm (Dosselaere et al., 1997). Một bản sao của gen trpG trong vi khuẩn loài
A. brasilense được liên kết với gen trpDC để hình thành các vùng gen
trpGDC, trong đó có hai sợi khởi đầu phiên mã, một cho gen trpGDC và một cho gen trpDC. Gen trpD mã hóa cho các enzyme anthranilate synthase, phosphoribosyl transferase và có thêm một nhóm enzyme phosphoribosyl anthranilate isomerase trong bước thứ hai của chu trình sinh tổng hợp tryptophan (Zimmer et al., 1991). Gen trpC được enzyme indoleglycerol phosphale synthase xúc tác ở bước thứ tư trong chu trình sinh tổng hợp tryptophan. Gen này có khả năng chống rối loạn trong các quá trình phiên mã của gen trpGDC hoặc trpDC. Loài vi khuẩn A. irakense KA3 có khả năng tổng hợp IAA ít hơn loài A. brasilense Sp7 khoảng mười lần. Các khu vực chịu trách nhiệm về tổng hợp IAA trong loài A. irakense tương ứng với quá trình trpD (Zimmer et al., 1991).
Nguồn: Holguin et al. (1999).
Chú thích: Mặc dù các gen trpA chỉ được tìm thấy ở loài A. lipoferum, nó được giả định để mã hóa các protein tương tự trong loài A. brasilense. TrpE(G) tổng hợp protein mã hóa bởi trpE và trpG; CP-PRA: N-(o-carboxyphenyl)-phosphoribosylamine; CDRP: N-(o-carboxyphenylamino)-1- deoxyribulose 5'-phosphate, InGP: indole-glycerol phosphate.
35