Để chứng minh phạm vi đa dạng phát sinh huyết thống các vi khuẩn nội sinh sống cộng sinh trong rễ lúa thì cần mô tả đặc điểm các chuỗi gen nifH phát sinh huyết thống có được bằng cách dùng kỹ thuật PCR của ADN vi sinh vật hỗn hợp chiết trực tiếp từ rễ lúa mà không cần nuôi cấy vi khuẩn. Những phân tích trình bày tám loại nifH mới mà dường như có các thành phần đa dạng về quần thể vi khuẩn nội sinh nổi trội, chủ yếu là Proteobacteria.
Gen nifH có chứa enzyme nitrogenase là một trong những gen chức năng, gen này đã tồn tại lâu đời nhất trong lịch sử tiến hóa về gen và hình thái của cây phát sinh loài ở gen nifH đã được nghiên cứu và khẳng định là phù
38
hợp với phát sinh chủng loại rARN (Young, 1992). Những đặc điểm này giúp nghiên cứu tính đa dạng trong di truyền của những vi khuẩn cố định đạm sinh học thông qua phân tích về tiến hóa phân tử của các chuỗi gen nifH đã được mở rộng trực tiếp từ ADN rễ lúa bởi vì ADN rễ lúa không chỉ chứa ADN thực vật mà còn chứa ADN vi sinh vật ở rễ, vùng rễ lúa thì cố định đạm liên kết với hoạt động của các vi khuẩn dị dưỡng cố định đạm (Hirota et al., 1978; Young, 1993). Các nhà khoa học sau một thời gian nghiên cứu và cho biết rằng tỷ lệ phần trăm của tổng số quần thể dị dưỡng ưa khí ở rễ là vi khuẩn nội sinh (Bally et al., 1988; Ozaizu-Masuchi et al., 1988).
2.5.4.3 Chức năng gen nif của vi khuẩn Azospirillum
Các nhà nghiên cứu đã tốn nhiều công sức để nghiên cứu và nâng cao chức năng cố định đạm của các vi khuẩn như Azospirillum nhằm cung cấp đạm sinh học tốt hơn cho các mùa vụ của cây trồng. Cố định đạm cải thiện sự tăng trưởng của thực vật được xử lý bằng vi khuẩn Azospirillum. Điều này được suy ra từ những quan sát về mức độ cộng sinh tăng lên với thực vật được cấy. Tuy nhiên, một số nhà nghiên cứu tin rằng sự góp phần của việc cố định đạm của vi khuẩn Azospirillum cho thực vật là tối thiểu. Hiện tại đang phát triển các con đường nghiên cứu thay thế để cải thiện việc chuyển cố định đạm sinh học cho thực vật. Các phương pháp này gồm việc tạo ra các thể đột biến bài tiết ammoniac, sự hình thành nốt rễ và sử dụng các vi khuẩn nội ký sinh (Holguin et al., 1999).
Quá trình cố định đạm được xúc tác bằng phức hợp enzyme nitrogenase gồm dinitrogenase-enzyme khử nitơ (protein MoFe, các sản phẩm gen nifDK), chứa điểm hoạt động khử cho dinitrogen và dinitrogenase reductase (protein Fe, sản phẩm gen nifH) cung cấp khả năng khử cho dinitrogenase (Vander Brock và Vanderleyden, 1995). Enzyme nitrogenase được kiểm soát rất kỹ thông qua mức độ phiên mã và sau dịch mã bằng nồng độ đạm và oxy trong tế
bào. Hệ thống DRAT/DRAG (Dinitrogenase Reductase ADP-
ribosyltransferase/Genase Reductase Aactivating Glycohydrolase) có liên quan đến việc bất hoạt nghịch đảo của enzyme nitrogenase qua ADP ribosylation đáp lại nồng độ rất nhỏ của amoniac (Zhang et al., 1992) được mô tả tốt nhất cho loài vi khuẩn quang hợp Rhodospirillum rubrurn. Các gen draTG của loài A. lipoferum được nhận dạng bằng cách lai với gen draT của loài Rhodospirillum rubrurn (Fu et al., 1990) và sau dùng làm mẫu dò (probe) để phân lập các gen
draTG của loài A. brasilense (Zhang et al., 1992).
Hai vùng gen được các nhà khoa học quan tâm nhiều là gen nifDK và
39
phứ hợp enzyme cấu trúc tứ phân (22 và N2E2). Thứ hai, enzyme nitrogenase chứa hai cụm kim loại hiếm bất thường, đó là Molybdaenum (FeMo-cofactor) được xem là vị trí khử dinitrogen (Kim và Rees, 1992) và sự tổng hợp sinh học của nó cần các sản phẩm của nifNE và của một số gen nif
khác (Ludden, 1994; Dean et al., 1992). Roll et al. (1995) cho rằng gen nifNE đóng vai trò là một giá thể và ở đó phức hợp FeMo-cofactor được thiết lập và sau đó được thêm vào thành phần thứ nhất của Mo-enzyme nitrogenase. Các gen có liên quan đến cố định đạm được xác định ở Azospirillum (Bảng 2.17).
Cơ chế độc lập thứ hai được tiết lộ mặc dù chưa được hiểu hết. Nhìn chung, hệ thống điều chỉnh thứ hai này ít có hiệu quả hơn đối với hoạt tính enzyme nitrogenase đáp lại amonia so với hệ thống DRAT/DRAG (Zhang et al., 1996). Ở loài vi khuẩn R. rubrum điểm ADP ribosylation ở dinitrogenase reductase (sản phẩm nifH) là chất cặn arginine đặc hiệu. Ở Azospirillum thay thế chất cặn arginine của nifH bằng acid amin Tyrosine hay Phenylalanine bằng cách phát sinh đột biến do chuỗi điều khiển loại bỏ ADP ribosylation. Tuy nhiên, enzyme nitrogenase vẫn còn bị ammonia ức chế cho thấy cơ chế điều chỉnh sau dịch mã của hoạt tính enzyme nitrogenase độc lập hệ thống DRAT/DRAG (Zhang et al., 1996).
Vander Brock et al. (1996) phát hiện rằng mức độ tối ưu của sức căng oxy cho enzyme nitrogenase là thuộc tính ở A. brasilense khoảng 0,3-1,0% và cố định đạm không xảy ra nếu sức căng oxy trên 2,0% trong khi ở A. irakense
thì sức căng oxy tối đa có thể chịu được là 2,5%. Tại nồng độ oxy cao thì enzyme nitrogenase bị bất hoạt một chiều bởi quá trình oxy hóa các trung khu kim loại lưu huỳnh của protein (Vander Brock và Vanderleyden, 1995).
Điều chỉnh biểu hiện gen nif ở Azospirillum, nhận dạng và tổ chức các gen này được điểm qua bởi Elmerich et al. (1997) không giống với một số vi khuẩn cố định đạm sống tự do khác, các gen nif của Azospirillum nằm ở nhiễm sắc thể. Các gen nif ở giống A. brasilense nằm ít nhất ở bốn hệ gen khác nhau tối thiểu trãi dài trên đoạn ADN có kích thước 65 kb (Singh et al., 1989). Đoạn ADN có kích thước 30kb chứa nifHDKY, nifENX, nifUSV, nifW,
fixABCX (Galimand et al., 1989; Pasaglia et al., 1991, 1995; Milcamps et al., 1993; Frazzon et al., 1995). Các gen draTG nằm ở ngược dòng của nifHDKY, đoạn khác chứa các gen nifA và nifB (Liang et al., 1991).
Phân tích chuỗi nucleotide ngược dòng của đoạn khung đọc mở nifH cho thấy gen khởi điểm phụ thuộc RpoN (Fani et al., 1989). Biểu diễn gen nifH chỉ xảy ra trong những điều kiện hạn chế đạm, khô cằng, sức căng oxy thấp (Vander Brock et al., 1992).
40
Bảng 2.17: Những gen cố định đạm của Azospirillum đã được xác định.
Chú thích: Trong một số trường hợp, chức năng các gen cố định đạm của Azospirillum được suy ra từ chức năng của loài Klebsiella pneumoniae hoặc các gen fixABCX trong giống Rhizobium spp. Nguồn: Holguin et al. (1999).
Hầu hết các gen khởi đầu phụ thuộc RpoN cần các protein hoạt hóa phiên mã như nifA mà có hoạt tính được điều biến bằng các dấu hiệu sinh lý (Merick, 1992). Tương tự với các vi khuẩn cố định đạm khác, phiên mã khởi nguồn từ gen khởi đầu phụ thuộc RpoN của vùng nifHDK ở loài A. brasilense
41
(polypeptide) của dòng A. brasilense Sp7 tương tự với các protein nifA khác (Michiels et al., 1994).
Ở hầu hết ở các vi khuẩn thì hai enzym GS và GltS chịu trách nhiệm xúc tác quá trình cố định đạm. Những phản ứng này cung cấp cho tế bào các chất trung gian chủ yếu cho việc chuyển hóa đạm, có nghĩa là chuyển hóa - ketoglutarate thành L-glutamate (Moat và Foster, 1998) (Hình 2.15). Con đường GS-GltS thực hiện chức năng ở nồng độ ammonia thấp (nhỏ hơn 1mM) khi khử đạm là nguồn đạm. Hoạt tính ở loài A. brasilense được điều biến bởi adenylylation đảo ngược đáp lại trạng thái đạm của tế bào. Ở những tế bào phát triển trong những điều kiện quá nhiều ammonia thì mức độ adenylylation tăng lên, trong khi đó thì ở những điều kiện giới hạn đạm GS được duy trì ở trạng thái hoạt hóa không bị adenylylated (de Zamaroczy 1993).
Trong những điều kiện hạn chế đạm, việc tổng hợp PII cũng gia tăng. Proreim này giữ vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh cố định đạm bằng cách kiểm soát hoạt tính nifA. Bằng cách thiết kế đoạn khuyết ở chuỗi ghi mã
nifA vùng cuối acid amin và bằng cách xác định xem protein nifA- có thể phục hồi việc cố định đạm ở thể đột biến hay không (nifA-, GlnB-, và nifA-/GlnB-) (Arsène et al., 1996) cho thấy rằng khi có mặt ammonia thì vùng cuối N của
nifA ức chế hoạt tính củ a toà n bộ prot ein nifA và PI I đ ược đáp lại tỷ lệ gi ữa các nồn g độ -ketoglutarate và acid glutamine, mặc dù người ta chưa chứng minh đ ối với vi khuẩn giống Azospirillum spp. Nhưng mẫu này vẫn thu hút loài A. brasilense chứa hai protein PII khác nhau nhưng tương tự về cấu trúc. Protein PII thứ hai (PZ) được ghi mã bởi glnZ và có thể có liên quan đến bước điều chỉnh chuyển hóa đạm ở A. brasilense (de Zamaroczy et al., 1996). Ở Azospirillum, glnB nằm ở ngược dòng glnA (ghi mã GS) hình thành cụm glnB-glnA. Phiên mã glnAB phụ thuộc vào ba gen khởi đầu do đạm điều chỉnh và được sử dụng chọn lọc (de Zamaroczy et al., 1993).
Khi Mandal và Ghosh (1993) tạo ra thể đột biến GHS- thì họ phát hiện rằng thiếu hụt GHS dẫn đến các sai hỏng đồng hóa đạm đa hiệu. Gen cấu trúc ghi mã cho cấu trúc siêu phân tử và của GHS (có nghĩa là gltB và gltD) được nhận dạng bằng bổ trợ thể đột biến GHS của A. brasilense. Chuỗi acid amin của chuỗi peptide được ghi mã thể hiện nhiều điểm tương đồng với GHS từ Escherichia coli (Pelanda et at., 1993; Mandal và Ghosh, 1993), trái với
Escherichia coli, loài A. brasilense có gltD liên quan đến gltB. Tuy nhiên, chuỗi gen khởi đầu của gltB khác ở hai vi khuẩn. Trong khi gen của loài vi khuẩn A. brasilense có điểm nhận biết và thì gen của loài vi khuẩn
42
Hình thành một enzyme nitrogenase chức năng trong loài A. brasilense
chủ yếu là kiểm soát ở mức độ phiên mã của gen cấu trúc enzyme nitrogenase (nifHDK) điều đó chỉ xảy ra dưới điều kiện hạn chế nitơ. Enzyme nitrogenase hoạt động cũng quy định ở mức sau tịnh bởi hai cơ chế. Các dinitrogenase reductase ADP ribosyltransferase/dinitrogenase reductase kích hoạt glycohydrolase trong đó có việc khử hoạt enzyme nitrogenase ngược chiều qua ADP ribosylation để đáp ứng với nồng độ mol rất nhỏ của ammonia (Zhang et al., 1992) đã được miêu tả tốt nhất cho các loài vi khuẩn quang hợp
R. rubrum. Các gen draTG của loài A. lipoferum đã được xác định bằng cách lai giống với các gen drat của R. rubrum (Fu et al., 1990). Và sau đó được sử dụng như là một thăm dò sự cô lập của các gen draTG loài A. brasilense
(Zhang et al., 1992). Trong loài vi khuẩn R. rubrum, khi tế bào đang hoạt động kém hoặc điều chỉnh bằng ammonia trong bất hoạt của enzyme, DRAT thực hiện việc chuyển giao từ ADP-NAD ribose đến reductase dinitrogenase. Khi đủ ánh sáng hoặc trong điều kiện hạn chế nitơ sẽ loại bỏ các ADP-ribose từ các enzyme sửa đổi và khôi phục lại hoạt động của nó (Zhang et al., 1992) hoặc trong trường hợp của các gen fixABCX từ chức năng của mình trong giống Rhizobium spp.
Một cơ chế độc lập thứ hai đã được đề xuất, mặc dù nó vẫn chưa được hiểu rõ. Nói chung, hệ thống quản lý thứ hai ít được chú ý, ít có hiệu lực vào hoạt động để phản ứng giữa enzyme nitrogenase và ammonia hơn vào hệ thống DRAT (Zhang et al., 1996). Ở vi khuẩn R. rubrum có cơ chế ADP ribosylation trong reductase dinitrogenase (sản phẩm của gen nifH) là một dư lượng arginine đặc biệt. Trong giống Azospirillum, sự thay thế của một dư lượng arginine của nifH với Tyrosine hoặc Phenylalanine bởi đột biến theo hướng loại bỏ ADP ribosylation. Tuy nhiên, enzyme nitrogenase vẫn còn bị ức chế bởi ammonia đã tiết lộ một cơ chế khác quy định của các hoạt động enzyme nitrogenase độc lập của hệ thống DRAT (Zhang et al., 1996) (Hình 2.15).
Nguồn: Zhang et al. (1992).
Hình 2.15: Chu trình hoạt động của enzyme nitrogenase do Ribosyltransferase Dinitrogenase Reductase-ADP/Dinitrogenase Reductase kích hoạt
43
2.5.5Tính đa dạng của enzyme cố định đạm nitrogenase 2.5.5.1 Cấu trúc, chức năng enzyme nitrogenase 2.5.5.1 Cấu trúc, chức năng enzyme nitrogenase
Khi các nhà khoa học nghiên cứu về sự đa dạng của enzyme cố định đạm nitrogenase thì đến nay phần lớn dựa trên các phân tích phát sinh loài của gen
nifH (Zehr và McReynolds, 1989) và đôi khi ở gen nifD (Ueda et al., 1995). Gen nifD và cuối cùng sẽ là gen nifK hữu ích vì nó không được rõ ràng bằng các phát sinh loài của nifH, nifD và nifK luôn nhất quán (Dominic et al., 2000). Tuy nhiên, có tương đối ít gen nifD và nifK có sẵn trình tự, do đó việc sử dụng những gen này vào thời điểm này được giới hạn trong phạm vi để phân tích phát sinh loài hay so sánh phát sinh loài. Những gen này, khi phát triển như là dấu mốc phát sinh loài, hứa hẹn sẽ cung cấp thêm cơ sở dữ liệu để nghiên cứu các chủng liên quan và làm cơ sơ để phân loại các thành viên khác trong gia đình gen nif.
Vật liệu di truyền acid nucleic được chiết xuất và phân tích thông qua phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược RT-PCR hoặc phân tích bằng chuỗi phản ứng polymerase PCR. Một bộ mồi được thiết kế cho phản ứng chuỗi PCR của gen nifH. Trong một số trường hợp, các đoạn mồi được thiết kế trên cơ sở các nhóm dự kiến phát sinh loài. Các chất chiết xuất từ acid nucleic được khuếch đại bằng kỹ thuật RT-PCR hoặc PCR phản ánh sự đa dạng của các chuỗi gen của enzyme nitrogenase. Các trình tự thu được từ phương pháp phân tích khác nhau có thể phản ánh các điều kiện khác nhau về phản ứng chuỗi PCR (Hình 2.16 và Hình 2.17) (Poly et al., 2001).
Nguồn: http://www.google.com.vn/imgres?q=femo+molybdenum+nitrogenase
Hình 2.16: Cấu trúc của enzyme cố định đạm nitrogenase
Nguồn: http://www.google.com.vn/imgres?q=femo+cofactor+nitrogenase
Hình 2.17: Enzyme nitrogenase xúc tác phản ứng chuyển hoá đạm (trên) và cấu trúc của phức hợp FeMo trong enzyme nitrogenase (dưới)
44
2.5.5.2 Các yếu tố hạn chế biểu hiện của enzyme nitrogenase
Nitơ phân tử (N2) là một nguồn tiềm năng của đạm mà cuối cùng phải giảm bớt đạm giới hạn trong môi trường, trừ khi các yếu tố khác cố định đạm (Redfield, 1958; Howarth và Marino, 1988; Vitousek và Howarth, 1991; Vitousek, 1999). Nó thường được giả định rằng các gen là cuối cùng không được giữ lại bởi các vi sinh vật, trừ trường hợp được chức năng và do đó được lựa chọn trong môi trường. Trong trường hợp của enzyme nitrogenase, điều này dường như đặc biệt đúng bởi vì nhóm gen cố định đạm có thể gồm khoảng hai mươi gen ngay cả trong các vi sinh vật sống tự do. Có vẻ như có khả năng rằng sự hiện diện và sự đa dạng của các gen có thể phản ánh enzyme nitrogenase lựa chọn do mức độ nitơ giới hạn trong môi trường sống.
Một trong những mô hình thú vị là sự đa dạng của các enzyme nitrogenase không trực tiếp liên quan đến mức độ nitơ giới hạn. Các nghiên cứu về đại dương đã được thực hiện trong vùng cận nhiệt đới, nơi có mức độ gần như không thể phát hiện các cố định nitơ vô cơ (Karl và Michaels, 1996). Những dữ liệu này chỉ ra rằng phân phối tổ hợp gen trong tự nhiên là một chức năng lựa chọn không chỉ yếu tố môi trường mà còn có yếu tố vật lý, hóa học, vận chuyển vật chất của các tế bào giữa các môi trường sống. Tổ hợp ở vi khuẩn có thể phản ánh một thành phần quan trọng, trong đó có ý nghĩa cho cấu trúc và chức năng của các cộng đồng vi sinh vật. Rõ ràng sự hiện diện của một gen trong một môi trường sống, có thể là enzyme nitrogenase hoặc gen chức năng khác và có thể không liên quan trực tiếp đến quá trình xúc tác bởi các protein thể hiện. Tuy nhiên, sự hiện diện của gen có thể cung cấp chức năng đánh dấu cho sự chuyển động và thành phần của các cộng đồng vi khuẩn. Phân tích các biểu hiện gen đã cho thấy rằng không phải tất cả các gen
nif đang có hiện nay được thể hiện cùng lúc khi phân tích (Noda et al., 1999; Zani et al., 2000). Mặc dù các dòng vi khuẩn đều có cơ chế kiểm soát sự biểu hiện gen của enzyme nitrogenase. Tương tác giữa vi sinh vật, chẳng hạn như việc cung cấp chu trình phân giải các chất hữu cơ từ vi khuẩn dị dưỡng cũng như ở vi khuẩn nội sinh có thể kiểm soát quá trình biểu hiện của gen nif.
2.6 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ AZOSPIRILLUM TRÊN THẾ GIỚI VÀ
VIỆT NAM
Bằng việc đánh giá các số liệu toàn cầu suốt hai mươi năm qua về các thí nghiệm trên đồng ruộng có chủng vi khuẩn Azospirillum, các nhà khoa học đã kết luận là các vi khuẩn này có khả năng kích thích cây trồng gia tăng năng