Các đặc tính về hình dạng, khả năng chuyển động, kích thước và Gram của các dòng vi khuẩn đã phân lập giống như vi khuẩn Azospirillum mà Hall
58
và Krieg (1983), Krieg và Döbereiner (1984), Okon và Labandera-Gonzalez (1994), Bashan et al. (2004) đã mô tả. Vì vậy, những dòng vi khuẩn này được tiếp tục nhận diện và định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) để xác định chúng thuộc loài Azospirillum nào.
a) Trình tự các chu kỳ của phản ứng PCR
Căn cứ trên chuỗi trình tự gen nifH của ADN của vi khuẩn Azospirillum
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html), hai cặp mồi (primers) chuyên biệt được thiết kế để định danh các dòng vi khuẩn Azospirillum có trình tự như sau:
- Cặp mồi I (mồi xuôi: 5’-AGTAACCTCCCATGTCTTTG-3’ và mồi ngược: 5’-ACGAAGTGGATGAGCTGGG-3’).
- Cặp mồi II (mồi xuôi: 5’-GTAAATCCACCACCTCCC-3’ và mồi ngược: 5’-TGTAGATTTCCTGGGCCT-3’.
Sau khi đo nồng độ ADN của các dòng vi khuẩn đã phân lập ròng ở hai độ dài sóng 260 nm và 280 nm, tiến hành chạy phản ứng PCR bằng máy PCR Perkin Elmer PE 9700 (Hoa Kỳ) để nhận diện các dòng vi khuẩn với hai cặp mồi chuyên biệt nêu trên.
Thành phần cho một phản ứng PCR (25µL) gồm: 1,0 µL ADN vi khuẩn; 2,5 µL (10X) PCR buffer; 1,0 µL (10 µM) mồi xuôi; 1,0 µL (10 µM) mồi ngược; 1,0µL (25 µM) dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 0,5 µL (5U) Taq
polymerase và 18 µL nước cất tiệt trùng.
Chu kỳ phản ứng PCR qua các giai đoạn: Biến tính mẫu ADN ở 95oC (5 phút), thực hiện tiếp ở 95oC (1 phút), ở 55oC (1 phút), ở 72oC (1 phút) (lặp lại 30 chu kỳ bắt đầu từ bước 2 đến bước 4) và ở 72oC (10 phút).
b) Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di gel và chụp hình
Các bước chuẩn bị và điện di gel như sau: Agarose 1,2%.
TBE buffer 1X: 40 mL. Loading buffer (LB).
Nấu agarose khoảng 3-5 phút cho tan. Để agarose nguội tự nhiên khoảng 15 phút.
Bổ sung EtBr (2 L/100mL) vào dung dịch agarose: 0,8 L. Đổ agarose vào khuôn để định hình.
59
Load các mẫu vào giếng (10 L/giếng) trên gel agarose. Tiến hành chạy điện di gel ở hiệu điện thế 75 vôn trong 1 giờ.
Sau khi điện di gel chứa sản phẩm PCR xong, tiếp tục quan sát các băng (band) ADN trên gel bằng hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ) rồi so sánh kích thước ADN của gen nifH với vi khuẩn đối chứng dương
Azospirillumlipoferum (kích thước ADN là 400bp) và Azospirillum brasilense
(kích thước ADN là 650bp) để nhận diện các dòng vi khuẩn thuộc loài nào. Các dòng vi khuẩn Azospirillum sau khi định danh được đặt tên và ký hiệu lần lượt là: AzoHR, AzoT, AzoR, AzoCT, AzoCR,… và tiếp tục nghiên cứu đặc tính hình thái của các dòng vi khuẩn Azospirillum này.