2.5.5.1 Cấu trúc, chức năng enzyme nitrogenase
Khi các nhà khoa học nghiên cứu về sự đa dạng của enzyme cố định đạm nitrogenase thì đến nay phần lớn dựa trên các phân tích phát sinh loài của gen
nifH (Zehr và McReynolds, 1989) và đôi khi ở gen nifD (Ueda et al., 1995). Gen nifD và cuối cùng sẽ là gen nifK hữu ích vì nó không được rõ ràng bằng các phát sinh loài của nifH, nifD và nifK luôn nhất quán (Dominic et al., 2000). Tuy nhiên, có tương đối ít gen nifD và nifK có sẵn trình tự, do đó việc sử dụng những gen này vào thời điểm này được giới hạn trong phạm vi để phân tích phát sinh loài hay so sánh phát sinh loài. Những gen này, khi phát triển như là dấu mốc phát sinh loài, hứa hẹn sẽ cung cấp thêm cơ sở dữ liệu để nghiên cứu các chủng liên quan và làm cơ sơ để phân loại các thành viên khác trong gia đình gen nif.
Vật liệu di truyền acid nucleic được chiết xuất và phân tích thông qua phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược RT-PCR hoặc phân tích bằng chuỗi phản ứng polymerase PCR. Một bộ mồi được thiết kế cho phản ứng chuỗi PCR của gen nifH. Trong một số trường hợp, các đoạn mồi được thiết kế trên cơ sở các nhóm dự kiến phát sinh loài. Các chất chiết xuất từ acid nucleic được khuếch đại bằng kỹ thuật RT-PCR hoặc PCR phản ánh sự đa dạng của các chuỗi gen của enzyme nitrogenase. Các trình tự thu được từ phương pháp phân tích khác nhau có thể phản ánh các điều kiện khác nhau về phản ứng chuỗi PCR (Hình 2.16 và Hình 2.17) (Poly et al., 2001).
Nguồn: http://www.google.com.vn/imgres?q=femo+molybdenum+nitrogenase
Hình 2.16: Cấu trúc của enzyme cố định đạm nitrogenase
Nguồn: http://www.google.com.vn/imgres?q=femo+cofactor+nitrogenase
Hình 2.17: Enzyme nitrogenase xúc tác phản ứng chuyển hoá đạm (trên) và cấu trúc của phức hợp FeMo trong enzyme nitrogenase (dưới)
44
2.5.5.2 Các yếu tố hạn chế biểu hiện của enzyme nitrogenase
Nitơ phân tử (N2) là một nguồn tiềm năng của đạm mà cuối cùng phải giảm bớt đạm giới hạn trong môi trường, trừ khi các yếu tố khác cố định đạm (Redfield, 1958; Howarth và Marino, 1988; Vitousek và Howarth, 1991; Vitousek, 1999). Nó thường được giả định rằng các gen là cuối cùng không được giữ lại bởi các vi sinh vật, trừ trường hợp được chức năng và do đó được lựa chọn trong môi trường. Trong trường hợp của enzyme nitrogenase, điều này dường như đặc biệt đúng bởi vì nhóm gen cố định đạm có thể gồm khoảng hai mươi gen ngay cả trong các vi sinh vật sống tự do. Có vẻ như có khả năng rằng sự hiện diện và sự đa dạng của các gen có thể phản ánh enzyme nitrogenase lựa chọn do mức độ nitơ giới hạn trong môi trường sống.
Một trong những mô hình thú vị là sự đa dạng của các enzyme nitrogenase không trực tiếp liên quan đến mức độ nitơ giới hạn. Các nghiên cứu về đại dương đã được thực hiện trong vùng cận nhiệt đới, nơi có mức độ gần như không thể phát hiện các cố định nitơ vô cơ (Karl và Michaels, 1996). Những dữ liệu này chỉ ra rằng phân phối tổ hợp gen trong tự nhiên là một chức năng lựa chọn không chỉ yếu tố môi trường mà còn có yếu tố vật lý, hóa học, vận chuyển vật chất của các tế bào giữa các môi trường sống. Tổ hợp ở vi khuẩn có thể phản ánh một thành phần quan trọng, trong đó có ý nghĩa cho cấu trúc và chức năng của các cộng đồng vi sinh vật. Rõ ràng sự hiện diện của một gen trong một môi trường sống, có thể là enzyme nitrogenase hoặc gen chức năng khác và có thể không liên quan trực tiếp đến quá trình xúc tác bởi các protein thể hiện. Tuy nhiên, sự hiện diện của gen có thể cung cấp chức năng đánh dấu cho sự chuyển động và thành phần của các cộng đồng vi khuẩn. Phân tích các biểu hiện gen đã cho thấy rằng không phải tất cả các gen
nif đang có hiện nay được thể hiện cùng lúc khi phân tích (Noda et al., 1999; Zani et al., 2000). Mặc dù các dòng vi khuẩn đều có cơ chế kiểm soát sự biểu hiện gen của enzyme nitrogenase. Tương tác giữa vi sinh vật, chẳng hạn như việc cung cấp chu trình phân giải các chất hữu cơ từ vi khuẩn dị dưỡng cũng như ở vi khuẩn nội sinh có thể kiểm soát quá trình biểu hiện của gen nif.
2.6 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ AZOSPIRILLUM TRÊN THẾ GIỚI VÀ
VIỆT NAM
Bằng việc đánh giá các số liệu toàn cầu suốt hai mươi năm qua về các thí nghiệm trên đồng ruộng có chủng vi khuẩn Azospirillum, các nhà khoa học đã kết luận là các vi khuẩn này có khả năng kích thích cây trồng gia tăng năng suất trong các mùa vụ quan trọng cho nông nghiệp ở các loại đất khác nhau cũng như ở những vùng có khí hậu thời tiết khác nhau. Các giống Azospirillum
45
brasilense và Azospirillum lipoferum khác nhau đã được sử dụng để chủng cho các giống cây trồng thuộc các loài khác nhau. Theo Okon và Labandera- Gonzalez (1994) cho biết khoảng 60% đến 70% ở các cây trồng có chủng
Azospirillum đã giúp năng suất tăng từ 5% đến 30%.
Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện được các nhóm vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm cho cây lúa và giúp gia tăng năng suất lúa từ 15% đến 54% (Favilli et al., 1987; Omar et al., 1989). Các nhóm vi khuẩn này đã và đang được phân lập tại nhiều vùng sinh thái khác nhau trên thế giới để tìm ra các loài thích hợp cho điều kiện khí hậu, đất đai của mỗi nước và cho các giống lúa được sản xuất (Baldani et al., 1987; Okon và Labandera-Gonzalez, 1994).
Một số nước trên thế giới đã sử dụng phân bón sinh học thành công như: Hoa Kỳ, Ấn Độ, Thái Lan, Israel, Ai Cập, Ý, Pháp, Brazin, Mexico, Uruguay, Argentina, Việt Nam,…
Ở Hoa Kỳ, phần lớn công trình có chủng Azospirillum được thực hiện bởi một nhóm nghiên cứu đến từ Gainesville, Florida trong dự án A.I.D. (1975-1984) với đề tài “Cố định đạm của hệ thống cộng sinh giữa vi khuẩn và cỏ” (Smith et al., 1984). Khi chủng các dòng vi khuẩn Azospirillum cho các loại cỏ sẽ giúp cố định được khoảng 40 kgN/ha/năm (Smith et al., 1978).
Ở Ấn Độ, nhiều thí nghiệm có chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum brasilense giúp tăng năng suất 15% so với không chủng vi khuẩn (Rao, 1986). Tuy nhiên, theo Wani (1990) trong vòng 10 năm gần đây khi chủng vi khuẩn
Azospirillum thì thấy năng suất tăng 60% so với không chủng vi khuẩn.
Ở Thái Lan, khi chủng nhiều dòng vi khuẩn Azospirillum cho bắp cho thấy năng suất tăng từ 15% đến 35% so với đối chứng. Ở những lô đối chứng có bón 120 kg N/ha/năm giúp tăng năng suất 53%. Như vậy, chủng vi khuẩn có thể làm giảm đi từ 1/3 đến 1/2 lượng đạm cần thiết bón cho bắp (Vasuvat et al., 1986).
Ở Israel, khi chủng giống Azospirillum brasilense Cd với tỉ lệ 1.108 CFU/cây hay 1.107 CFU/hạt cho bắp, lúa mì, lúa miến, cỏ, hạt ngũ cốc và đậu giúp cây trồng tăng năng suất từ 15% đến 20%. Trong 12 thí nghiệm trên bắp, năng suất gia tăng từ 20% đến 30% so với mẫu đối chứng (Okon et al., 1988).
Ở Ai Cập, khi sử dụng phương pháp chủng vi khuẩn kết hợp với chất hữu cơ (như rơm, phân xanh) giúp tăng năng suất cho cây trồng (Sumner, 1990). Khi chủng giống Azospirillum brasilense N040 làm gia tăng sản lượng cho lúa từ 15% đến 20% (Oma et al., 1989).
46
Ở Ý, trong 18 thí nghiệm được thực hiện trên đồng ruộng có chủng
Azospirillum đều nhận thấy năng suất mùa vụ gia tăng đáng kể từ 3% đến 54% so với không chủng vi khuẩn (Favilli et al., 1987).
Ở Pháp, một sản phẩm thương mại có tên là Azo-GreenTM đã giúp tăng năng suất bắp trên 100% (Fages, 1994).
Ở Brazin, năm 1993 khi chủng Azospirillum brasilense giống Sp-245 và Sp-107 giúp gia tăng trọng lượng khô và nồng độ đạm cho cây trồng, bên cạnh đó giống Sp-245 và Sp-245 NR cũng làm gia tăng nồng độ đạm tổng cộng của cây trồng và năng suất ngũ cốc (Baldani et al., 1987).
Ở Mexico, Đại học Puebla đã dùng phương pháp chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum ngoài đồng ruộng cho lúa mì thì nhận thấy năng suất gia tăng từ 23% đến 63% (năm 1986) và từ 24% đến 43% (năm 1987) (Caballero- Mellado et al., 1992; Paredes-Cardona et al., 1988).
Ở Uruguay, những thí nghiệm ngoài đồng ruộng trên lúa miến cho thấy khi có chủng giống Azospirillum brasilense cd vào hạt lúa miến (1.107 CFU/hạt) làm gia tăng năng suất từ 10% đến 15% (Okon và Labandera- Gonzalez, 1994).
Ở Argentina, nhiều thí nghiệm cho thấy khi chủng giống Azospirillum brasilense làm tăng năng suất lúa mì 33% so với không chủng vi khuẩn (Barrios et al., 1986).
Ở Việt Nam, các bước đầu nghiên cứu ở ĐBSCL cho thấy khi chủng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân cho đậu nành đã giúp gia tăng năng suất đậu nành một cách đáng kể (Hiep et al., 2002; Hiep và Diep, 2003). Từ trước đến nay, chỉ có vài thông báo cho biết sử dụng chế phẩm vi sinh của nước ngoài là nhúng rễ mạ vào dung dịch chế phẩm cố định đạm Azospirillum trước khi cấy sẽ giúp tăng năng suất lúa và làm giảm số lượng phân đạm hoá học cần bón (Nguyễn Phước Tương, 1989). Bước đầu nghiên cứu trên cây lúa hoang, lúa trồng và một số loại cỏ họ hòa bản ở ĐBSCL, người ta đã phân lập và nhận diện được một số dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum và Azospirillum brasilense (Đào Thanh Hoàng, 2005; Nguyễn Khắc Minh Loan, 2005). Tuy nhiên, cho đến nay ở ĐBSCL nói chung và tại tỉnh An Giang nói riêng thì chưa có nghiên cứu nào mới về tác dụng cộng sinh của vi khuẩn họ
47
2.7 KỸ THUẬT PCR
2.7.1 Khái quát về kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR dùng để nhận diện nhanh vi khuẩn Azospirillum được nhiều tác giả sử dụng thành công như: Fani et al. (1993) dùng các mồi (primers) NP2, a23-mer (5’-CGGGGGACTGTTGGGCGCCATCT) với nồng độ G+C là 69% và Tm là 78oC để định danh các loài Azospirillum. Stoltzfus et al. (1997) khi nghiên cứu về Azospirillum đã sử dụng các mồi FdB261 (5’- TGGGGICCIRTIAARGAYATG-3’) và FdB260 (5’-TCRTTIGCIATRTGRTGNCC-3’) để định danh chúng. Khi nghiên cứu định danh các dòng vi khuẩn Azospirillum
Ueda et al. (1995) đã sử dụng các đoạn mồi EMBL, DDBJ có trình tự GCIWTYTAYGGIAARGGIGG cho 19F và AAICCRCCRCAIACIACRTC cho 407R (I đại diện cho inosine, R đại diện A hoặc G, W đại diện A hoặc T và Y đại diện C hoặc T). Fancelli et al. (1998) sử dụng đoạn mồi có trình tự (5’-GTTTCCGCCC-3’) để định danh vi khuẩn Azospirillum sp.
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase do Karl Mullis et al. (2005) phát minh. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm có ba bước:
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94oC đến 95oC trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi (primers) bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC đến 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization).
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho ADN polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation).
Một chu kỳ bao gồm ba bước như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
Theo lý thuyết có ba đoạn acid nucleic, một đoạn đôi ADN được khuyếch đại và hai sợi đơn primer oligonucleotid sẽ chạy xung quanh đoạn
48
ADN, thêm vào là thành phần protein (ADN polymerase, dNTPs và một dung dịch muối) (Hình 2.18) (Nguyễn Thị Lang, 2002).
2.7.2 Trình tự các bước thực hiện phản ứng PCR
- Dung dịch dùng cho phản ứng PCR: Nước cất vô trùng, 15 µg/mL AND, 10X buffer, 2,5 Taq polymerase, 1 giọt dầu, 50 µM oligonucleotid primer I và II, 2 mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
- Các thành phần dung dịch dùng cho một phản ứng PCR (Bảng 2.18). Bảng 2.18: Thành phần dung dịch dùng cho phản ứng PCR. Stt Thành phần Nồng độ Thể tích 1 2 3 4 5 6 7 ADN vi khuẩn PCR buffer Mồi xuôi Mồi ngược dNTPs Taq polymerase Nước nước cất khử trùng 10X 10 µM 10 µM 25 µM 5U 1,0µL 2,5µL 1,0µL 1,0µL 1,0µL 0,5µL 18,0µL Tổng cộng 25,0µL
Nguồn: Nguyễn Thị Lang, (2002).
- Đặt các dung dịch vào máy PCR.
- Thiết lập các chu kỳ cho phản ứng PCR: Thực hiện ở 95oC (5 phút). Lặp lại 30 chu kỳ ở các nhiệt độ: 95oC (1 phút), 40oC đến 70oC (1 phút), 72oC (1 phút) và 72oC (10 phút). Lưu trữ sản phẩm PCR ở 4oC (nếu chưa sử dụng liền).
- Các sản phẩm sau khi được khuếch đại bằng phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên gel agarose 0,3% đến 3% có thêm Ethidium bromide (EtBr) (Nguyễn Thị Lang, 2002).
- Sau khi chạy điện di sản phẩm PCR và quan sát các băng (band) ADN trên gel bằng hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ) để nhận diện các dòng vi khuẩn Azospirillum.
49
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.1.1Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Các máy móc, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm hiện có tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Phòng Thí nghiệm chuyên sâu, Trường Đại học Cần Thơ. Một số thiết bị, dụng cụ chính dùng để phân lập và định danh vi khuẩn Azospirillum được liệt kê chi tiết dưới đây:
Tủ cấy vi sinh vật (Pháp).
Tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức). Kính hiển vi Olympus CHT (Nhật Bản). Kính hiển vi Olympus BH-2 (Nhật Bản).
Kính hiển vi điện tử quét JBS 5500 (Nhật Bản). Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức). pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ).
Cân điện tử Sartorius (Đức).
Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan). Tủ sấy EHRET (Đức).
Tủ lạnh -20oC Electrolux Confor Plus (Thụy Điển). Tủ lạnh -4oCAkira (Việt Nam).
Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức). Máy khuấy từ (Hoa Kỳ).
Máy chụp ảnh kỹ thuật số Sony P200 (Nhật Bản).
Máy tính Sony Vaio dùng để phân tích và lưu trữ số liệu (Hoa Kỳ). Máy PCR Perkin Elmer PE 9700 (Hoa Kỳ).
Hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ). Máy đo nồng độ ADN vi khuẩn Beckman DU-600 (Đức). Máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417C (Đức).
Máy ly tâm chân không Concentrator 5301 (Đức). Máy ủ cách thủy GFL 1083 (Đức).
Máy đo diệp lục tố SPAD (Hoa Kỳ). Ống nghiệm 15mL (Đức).
50 Đĩa petri đường kính 6cm, 10cm (Đức). Bộ điện di một chiều Embi-Tec (Hoa Kỳ).
Bộ micropipet Bio-Rad P10, P20, P200, P1000 (Hoa Kỳ). Bộ micropipet Gibson P10, P20, P200, P1000 (Đức).
Các loại ống tuýp (eppendorf) 1,5 mL và 2,0 mL dùng trích mẫu ADN, các loại tuýp nhỏ dùng cho phản ứng PCR.
Một số dụng cụ thí nghiệm khác như: Kính lúp, que cấy, lam, lam men, que thủy tinh, bi thủy tinh, kẹp, dao cắt mẫu, kéo cắt mẫu, cối nghiền mẫu, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, găng tay, xô trộn phân sinh học, chậu trồng cây,…
3.1.2Vật liệu thí nghiệm
Lúa cao sản và lúa hoang được thu hoạch tại các ruộng lúa của 11 huyện, thị, thành phố trong toàn tỉnh An Giang như: An Phú, Châu Đốc, Châu Phú, Châu Thành, Chợ Mới, Long Xuyên, Phú Tân, Tân Châu, Tịnh Biên, Tri Tôn và Thoại Sơn.
Giống lúa cao sản: OM 6976 và OM 4218 (Hình 3.1). Sử dụng hai dòng vi khuẩn Azospirillum đối chứng dương là Azospirillum brasilense và
Azospirillum lipoferum do Trường Đại học Florence, Ý cung cấp.
A B
C D
Chú thích: Lúa hoang (A), các dạng bông lúa hoang (B), các hạt lúa hoang có đuôi dài từ 3-7 cm (C) và lúa cao sản OM 4218 (D).
51
Sử dụng hai cặp mồi (primers) chuyên biệt do Tập đoàn Bioneer, Hàn Quốc sản xuất và cung cấp để định danh các dòng vi khuẩn đã được phân lập. Cặp mồi I: Dùng định danh loài vi khuẩn Azospirillum brasilense: Mồi xuôi (Forward primer): 5’-AGTAACCTCCCATGTCTTTG-3’ và Mồi ngược (Reverse primer): 5’-ACGAAGTGGATGAGCTGGG-3’. Cặp mồi II: Dùng định danh loài vi khuẩn Azospirillum lipoferum: Mồi xuôi (Forward primer):