Đặc tính hình thái, sinh lý của vi khuẩn Azospirillum

Azospirillum là vi khuẩn có hình que thẳng hay hơi cong, kích thước tế bào rộng 0,6-1,7µm và dài 2,1-3,8µm. Tế bào vi khuẩn Azospirillum có chứa các hạt poly-β-hydrobutyrate (PHB). Vi khuẩn Azospirillum thuộc Gram âm hay Gram thay đổi, có thể chuyển động trong môi trường lỏng nhờ có một chiên mao ở đầu tế bào. Ở môi trường đặc 30oC, nhiều chiên mao bên có thể hình thành. Vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm biểu hiện qua khả năng sinh trưởng trong môi trường không có chứa đạm ở điều kiện vi hiếu khí. Vi khuẩn này có thể phát triển trong môi trường có nguồn đạm là ammonium hay muối glutamate nhưng nếu môi trường có chứa nồng độ đạm cao thì enzyme nitrogenase sẽ bị ức chế. Nhiệt độ tối ưu để vi khuẩn Azospirillum

phát triển từ 33-41oC và pH từ 5,5-7,5. Một số dòng vi khuẩn Azospirillum có thể có khuẩn lạc có màu hồng nhạt hay đậm, bề mặt khuẩn lạc nhăn nheo không trơn láng trên môi trường khoai tây agar. Phản ứng oxidase dương tính. Vi khuẩn Azospirillum phát triển trong môi trường khoáng hữu cơ. Đặc biệt là chúng phát triển tốt trong môi trường có muối của các acid hữu cơ như malate, succinate, lactate hay pyruvate. D-fructose và một số carbohydrate có thể được vi khuẩn sử dụng làm nguồn carbon. Một số loài Azospirillum có thể phát triển ở môi trường có nồng độ muối 3%. Vi khuẩn Azospirillum có thể sống tự do trong đất hay sống nội sinh với rễ, thân, lá và hạt một số loại ngũ cốc, rau, trái cây, cây họ đậu, cây có củ nhưng không tìm thấy ở nốt rễ cây họ đậu. Cho đến

15

nay có nhiều loài Azospirillum đã được tìm thấy và định danh (Bảng 2.6) (Brenner et al., 2005).

Vi khuẩn thuộc giống Azospirillum spp. được phân lập từ vùng thân, lá, rễ, củ, trái, hạt, nhựa nguyên của nhiều loại cây trồng như lúa, ngũ cốc, cỏ, mía, cây có củ và cây cọ dầu; từ đất nông nghiệp, đất nhiễm dầu và hợp chất hữu cơ. Các vi khuẩn Azospirillum này là những vi sinh vật cố định đạm khi chúng sống tự do hay cộng sinh với cây trồng. Mối quan hệ cộng sinh giữa

Azospirillum với cây trồng ở vùng rễ của cây có thể dẫn đến gia tăng hiệu quả việc sử dụng phân bón. Nhiều nghiên cứu gần đây mô tả ảnh hưởng có lợi của phương pháp chủng vi khuẩn Azospirillum đối với sự phát triển của cây trồng, do đó các vi sinh vật thuộc giống Azospirillum spp. này rất được quan tâm (Döbereiner et al., 1995; Okon, 1985). Các nhà khoa học đã chứng minh

Azospirillum là vi khuẩn có khả năng cố định đạm và cộng sinh với cây lúa, vì vậy cây trồng có thể sử dụng lượng đạm tự do trong không khí dưới dạng phân tử nitơ (N2) do vi khuẩn tổng hợp được. Mặt khác, vi khuẩn Azospirillum được biết đến chính là nhờ khả năng tổng hợp những hợp chất kích thích tăng trưởng cho cây trồng, giúp hệ thống rễ của cây phát triển mạnh nhờ đó cây trồng sẽ hấp thu nước và các khoáng chất tốt hơn, giúp cây trồng gia tăng sản lượng và khả năng chịu hạn (Okon, 1985).

Azospirillum là loài vi khuẩn sống cộng sinh với cây trồng được dùng để sản suất phân sinh học bón cho lúa. Azospirillum phát triển nhanh ở vùng rễ cây lúa và có khả năng cố định đạm. Ngoài ra, Azospirillum còn có khả năng hòa tan phospho cung cấp cho cây trồng. Bên cạnh đó, chúng còn giúp cho cây trồng chịu được hạn hán khi cây không được tưới tiêu hay khi trời không mưa. Bằng cách ứng dụng vi khuẩn Azospirillum có thể giảm được 30% việc sử dụng phân đạm hoá học trong canh tác cây trồng nói chung và cho cây lúa nói riêng (Roger và Ladha, 1992).

Các vi khuẩn thuộc loài Azospirillum sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí lẫn hiếu khí. Tuy nhiên, chúng phát triển thích hợp và tối ưu nhất ở điều kiện vi hiếu khí khi có hay không có đạm kết hợp trong môi trường nuôi (Döbereiner và Pedrosa, 1987). Một số dòng vi khuẩn Azospirillum là những vi sinh vật sống tự dưỡng không bắt buộc. Vi khuẩn Azospirillum sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường có chứa muối của những acid hữu cơ như malate, succinate, lactate hay pyruvate. Mặt khác, đường fructose và những đường đơn khác cũng có thể được vi khuẩn sử dụng làm nguồn carbon. Một số dòng vi khuẩn trong loài Azospirillum trong quá trình sinh trưởng và phát triển ngoài nguồn carbon vi khuẩn còn cần vitamin H (Krieg và Döbereiner, 1984).

16

Vi khuẩn Azospirillum là các vi sinh vật cố định đạm. Cho đến nay, các nhà khoa học trên toàn thế giới đã phân lập và định danh được mười bảy loài

Azospirillum trong đó năm loài đã phát hiện trước đây là: A. brasilense, A. lipoferum, A. amazonense, A. halopraeferens và A. irakense (Hình 2.1, Hình 2.2, Hình 2.3, Hình 2.4 và Hình 2.5) (Bashan và Levanony, 1990; Bashan và Holguin, 1997; Döbereiner et al., 1995). Trong năm loài vi khuẩn

Azospirillum đã được phát hiện trước đây thì các nhà khoa học nhận thấy rằng, tất cả chúng đều có Gram âm hay thay đổi, hình dạng thể xoắn hơi cong như hình dấu phẩy (vibrio) hoặc dạng xoắn khuẩn, chiều dài 2,1-3,8m và chiều rộng 1,0m, chúng có thể chuyển động được trong môi trường lỏng nhờ có chiên mao dài phân cực ở đầu (polar flagellum) tế bào, trong môi trường bán đặc ở 30oC nhiều chiên mao bên (lateral flagella) ngắn hơn cũng được hình thành, vi khuẩn dùng chiên mao bên để kết bầy trong môi trường bán đặc (Hình 2.1 và Hình 2.2). Bên cạnh đó, các hạt poly-β-hydroxybutyrat (PHB) lắp đầy đa phần tế bào vi khuẩn và các vùng này hình thành sắc tố hồng để chống lại sự oxy hóa enzyme cố đinh đạm nitrogenase ở trong gen nifH của

Azospirillum (Hall và Krieg, 1983; Okon và Labandera-Gonzalez, 1994; Krieg và Döbereiner, 1984).

Vi khuẩn A. doebereinerae và A. largomobile là hai trong số mười bảy loài mới phát hiện sau này. Trong đó, loài A. doebereinerae được tìm thấy trong sự cộng sinh với rễ của cỏ họ Miscanthus. Tế bào của hai loài này có dạng hình que cong hoặc hình chữ S, chiều dài 2,0-3,0m và chiều rộng 1,0- 1,5m, những đặc điểm còn lại thì hai loài này rất giống với năm loài

Azospirillum sp. đã được phát hiện trước đây. Mặt khác, điểm khác biệt nổi bật mà hai loài A. doebereinerae và A. largomobile khác với Azospirillum đã phát hiện trước đây là chúng có khả năng sử dụng (hoặc không sử dụng) một vài loại đường (dùng để làm nguồn carbon) và chúng còn khác ở một số chi tiết nhỏ về di truyền. Loài vi khuẩn A.doebereinerae sinh trưởng và phát triển tối ưu nhất ở 30oC với pH khoảng 6,0-7,0 nhưng chúng sẽ không phát triển khi nhiệt độ trên 37oC (Hình 2.9) (Dekhil et al., 1997; Eckert et al., 2001). Mặt khác, loài A. doebereinerae sp. nov. GSF71T được phân lập từ rễ cỏ họ

Miscanthus khi vi khuẩn sống cộng sinh, được nuôi cấy trên môi trường NFb, JNFb bán đặc hoặc DYGS lỏng. Vi khuẩn A. doebereinerae sp. nov. GSF71T thuộc Gram âm, tế bào có dạng hình que cong hoặc hình chữ S, chiều dài 2,0- 3,0m và chiều rộng 1,0-1,5m. Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, chúng hình thành chiên mao ở đầu và chuyển động trong dung dịch môi trường nuôi.

A. doebereinerae sp. nov. GSF71T sinh trưởng và phát triển ở pH 6,0-7,0, nhiệt độ tối ưu là 30oC và không phát triển khi nhiệt độ trên 37oC. Chúng có

17

thể sinh trưởng trên nhiều nguồn carbon khác nhau như: Arabinose, D- fructose, gluconate, glycerol, malate, mannitol và sorbitol (Hình 2.9) (Eckert

el al., 2001).

Vi khuẩn thuộc giống Azospirillum được Tarand xác định và định danh lại vào năm 1978 gồm hai loài là A. brasilense và A. lipoferum (Tarand et al., 1978) (Hình 2.1 và Hình 2.2). Nhiều nghiên cứu ban đầu về di truyền học, sinh học phân tử, sinh lý và sinh hóa của Azospirillum cố định đạm sinh học cho cây trồng nói chung và của hai loài A. brasilense và A. lipoferum nói riêng đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu gần một thế kỷ qua (Döbereiner và Pedrosa, 1987; Elmerich et al., 1992). Loài thứ 3 có tên là A. amazonense được phát hiện năm 1983 bởi Magalhães (Magalhães et al., 1983) (Hình 2.3) Loài thứ 4 được phát hiện năm 1987 có tên là A. halopraeferens bởi Reinhold (Reinhold et al., 1987) (Hình 2.4).

Chú thích: Chiên mao đầu (P) và Chiên mao bên (L). Nguồn: Krieg và Döbereiner, 1984.

Hình 2.1: Vi khuẩn A. brasilense ATCC 29145 được nuôi cấy trên môi trường MPSS ở 30oC trong 24 giờ với độ phóng đại 15.000 lần.

Chú thích: Chiên mao đầu (P) và Chiên mao bên (L). Nguồn: Đào Thanh Hoàng, (2005).

Hình 2.2: Vi khuẩn A. lipoferum A28 được phân lập từ rễ lúa MTL 405, được nuôi

cấy trên môi trường NFb ở 30oC và chụp bằng kính hiển vi điện tử quét ở độ phóng đại 20.000 lần.

P L

P

18

Nguồn: Brenner et al. (2005).

Hình 2.3: Vi khuẩn A. amazonense ATCC 35119 được nuôi cấy trên môi trường LGI

ở 30oC trong 24 giờ, các hạt PHB hiện diện trong tế bào và chụp bằng kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 13.000 lần.

Nguồn: http://images.google.com/images?q=Azospirillum+halopraeferens

Hình 2.4: Vi khuẩn A. halopraeferens được chụp bằng kính hiển vi điện tử quét.

Nguồn: Brenner et al. (2005).

Hình 2.5: Vi khuẩn A. irakense KBC1 phát triển ở 30oC trong 20 giờ trong môi trường dinh dưỡng, tế bào có dạng que cong hoặc chữ S.

A B

Nguồn: Eckert el al. (2001).

Hình 2.6: Vi khuẩn A.doebereinerae GSF71T phân lập từ rễ cỏ Miscanthus, được nuôi cấy 5 ngày trên môi trường NFb bán đặc (A) và DYGS lỏng (B) với thước đo 10µm.

19

Chú thích: Chiên mao đầu (P). Nguồn: Mehnaz et al. (2007).

Hình 2.7: Vi khuẩn A. canadense DS2T phân lập từ bắp, nuôi cấy trên môi trường M

ở 30oC, pH 7,2-7,4 trong 48-72 giờ và chụp bằng kính hiển vi điện tử quét với thước đo 0,6µm.

Chú thích: Chiên mao đầu (P). Nguồn: Mehnaz et al. (2007).

Hình 2.8: Vi khuẩn A. zeae N6 được phân lập từ bắp và chụp dưới kính hiển vi điện tử quét với thước đo 0,6µm.

Chú thích: Chiên mao đầu (P). Nguồn: Lin et al. (2009).

Hình 2.9: Vi khuẩn A. picis IMMIB TAR-3T được chụp bằng kính hiển vi điện tử quét, tế bào dạng que ngắn có chiên mao dài ở đầu với thước đo 0,5µm.

Nguồn: Lavrinenko et al. (2010).

Hình 2.10: Vi khuẩn A. thiophilum BV-ST được chụp bằng kính hiển vi điện tử quét.

P P

20

Lin et al. (2012).

Hình 2.11: Vi khuẩn A. formosense sp. nov. CC-Nfb-7T được phân lập từ đất nông nghiệp ở tỉnh Yunlin, Đài Loan và chụp bằng kính hiển vi điện tử quét.

Vi khuẩn A. canadense sp. nov. DS2T được phân lập từ cây bắp và nuôi cấy trên môi trường M không có Biotin (vitamin H), pH 7,2-7,4, ở 30oC trong 48-72 giờ. Khuẩn lạc của A. canadense sp. nov. có màu trắng sau đó chuyển dần sang trắng hồng. Khi quan sát tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét cho thấy tế bào của loài vi khuẩn A. canadense sp. nov. DS2T có chiều dài dao động trong khoảng 1,8-2,5m và chiều rộng khoảng 0,9m (Hình 2.7) (Mehnaz et al., 2007).

Các vi khuẩn Azospirillum tăng trưởng trong môi trường có nguồn đạm là muối ammonium, vi khuẩn không thể sử dụng đường đôi khi tăng trưởng. Tế bào vi khuẩn sống tự do trong đất hay sống cộng sinh với rễ của ngũ cốc, các loại cỏ và cây có củ (Nguyễn Hữu Hiệp et al., 2005). Một số loại cây trồng có sự hiện diện của các loài vi khuẩn Azospirillum ở các vị trí khác nhau trên cây được mô tả trong các bảng bên dưới (Bảng 2.6, Bảng 2.7 và Bảng 2.8).