Kỹ thuật PCR dùng để nhận diện nhanh vi khuẩn Azospirillum được nhiều tác giả sử dụng thành công như: Fani et al. (1993) dùng các mồi (primers) NP2, a23-mer (5’-CGGGGGACTGTTGGGCGCCATCT) với nồng độ G+C là 69% và Tm là 78oC để định danh các loài Azospirillum. Stoltzfus et al. (1997) khi nghiên cứu về Azospirillum đã sử dụng các mồi FdB261 (5’- TGGGGICCIRTIAARGAYATG-3’) và FdB260 (5’-TCRTTIGCIATRTGRTGNCC-3’) để định danh chúng. Khi nghiên cứu định danh các dòng vi khuẩn Azospirillum
Ueda et al. (1995) đã sử dụng các đoạn mồi EMBL, DDBJ có trình tự GCIWTYTAYGGIAARGGIGG cho 19F và AAICCRCCRCAIACIACRTC cho 407R (I đại diện cho inosine, R đại diện A hoặc G, W đại diện A hoặc T và Y đại diện C hoặc T). Fancelli et al. (1998) sử dụng đoạn mồi có trình tự (5’-GTTTCCGCCC-3’) để định danh vi khuẩn Azospirillum sp.
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase do Karl Mullis et al. (2005) phát minh. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm có ba bước:
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94oC đến 95oC trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi (primers) bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC đến 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization).
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho ADN polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation).
Một chu kỳ bao gồm ba bước như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
Theo lý thuyết có ba đoạn acid nucleic, một đoạn đôi ADN được khuyếch đại và hai sợi đơn primer oligonucleotid sẽ chạy xung quanh đoạn
48
ADN, thêm vào là thành phần protein (ADN polymerase, dNTPs và một dung dịch muối) (Hình 2.18) (Nguyễn Thị Lang, 2002).