Sau khi khử trùng các mẫu lúa hoang và lúa cao sản thì tiến hành phân lập vi khuẩn Azospirillum từ thân và rễ lúa. Các dòng vi khuẩn Azospirillum
sau khi được phân lập ròng thì được đặt tên và ký hiệu như sau: AzoHT, AzoHR, AzoT, AzoR, AzoCT, AzoCR,... (Hình 3.4 và Hình 3.5).
Phân lập vi khuẩn Azospirillum từ thân, rễ lúa hoang và lúa cao sản được thực hiện lần lượt theo các bước sau:
- Rửa thật sạch đất bám ở thân và rễ, sau đó tách rời thân và rễ.
- Lấy lớp vỏ ngoài của phần thân ra, rửa phần thân bằng nước, tiếp tục rửa bằng nước cất vô trùng, sau đó cắt thân (hay rễ) thành những đoạn nhỏ 2 – 3 cm rồi làm khô chúng bằng giấy hút ẩm.
- Rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng.
- Tiếp tục khử trùng thân (hay rễ) bằng dung dịch clorox 30% (trong 10 phút), cồn 80% (trong 5 phút), dung dịch H2O2 8% (trong 3 phút) và rửa lại 6 lần bằng nước cất vô trùng.
- Sau khi khử trùng thân (hay rễ) xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem nghiền mịn trong cối cùng với 1mL nước cất vô trùng.
- Lấy 10µL dung dịch nghiền ở trên cấy vào ống nghiệm chứa môi trường NFb bán đặc không bổ sung đạm, sau đó ủ ở 30oC trong tủ ủ Incucell 111 (Đức) để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
- Sau khoảng 1-3 ngày nuôi, khi thấy môi trường nuôi vi khuẩn xuất hiện một lớp màng mỏng trắng đục (pellicle) cách mặt môi trường bán đặc khoảng 0,5-1,5 cm, lấy 5-10µL dung dịch nuôi vùng này cấy sang đĩa petri chứa môi trường NFb đặc rồi tiếp tục đem ủ trong tủ ủ ở 30oC để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
- Tiếp tục theo dõi thường xuyên sự tăng trưởng của vi khuẩn và phân lập nhiều lần để tách ròng vi khuẩn.
- Trữ vi khuẩn đã phân lập ròng trong môi trường NFb có bổ sung đạm (1g KNO3/L) để định danh chúng bằng kỹ thuật PCR.
54
Nguồn: Stoltzfus et al. (1997).
Hình 3.3: Quy trình phân lập vi khuẩn Azospirillum từ cây lúa.
Các bước phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa cao sản trồng và lúa hoang được thực hiện theo các bước sau đây:
Lúa cao sản (lúa hoang) ↓ Rửa sạch ↓ Tách vỏ (thân) ↓ Rửa nước cất khử trùng (3 lần) ↓ Cắt nhỏ 2-3 cm ↓ Rửa nước cất khử trùng (3 lần) ↓ Khử trùng [Clorox 30% (10 phút), cồn 80% (5 phút) và H2O2 8% (3 phút)] ↓ Rửa nước cất khử trùng (6 lần) ↓
Nghiền mịn trong 1mL nước cất khử trùng ↓
Cấy 10-20µL dịch trích vào ống nghiệm (chứa môi trường NFb bán đặc, không đạm)
↓
Ủ 30oC (1-3 ngày) ↓
Cây lúa Khử trùng thân và rễ Nghiền mẫu
Cấy vào môi trường NFb bán đặc
Cấy chuyển sang môi trường NFb đặc
Phân lập và tách ròng
55
Cấy chuyển 5-10µL vào đĩa petri (chứa môi trường NFb đặc, không đạm)
↓ Tách ròng
↓
Trữ mẫu và danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Hình 3.4: Các bước phân lập vi khuẩn Azospirillum từ lúa cao sản và lúa hoang.