chuyển gen gặp khó khăn do nó có kích thƣớc lớn. Mặt khác, Ti-plasmid chứa các gen gây khối u gây bất lợi cho thực vật- cản trở quá trình sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng ở thực vật (Briew & Henrry, 2000). Các enzyme giới hạn có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở nhiều chỗ khác nhau. Trong khi đó cơng nghệ gen lại cần những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzym giới hạn (Lê Trần Bình et
al., 1997). Với các lí do trên đây, các nhà khoa học đã cải tiến Ti-plasmid thành một
hệ vector nhị thể gồm có vector chuyển gen (Ti-plasmid tái tổ hợp) và vector bổ trợ (helper T-plasmid). (i) Vector chuyển gen có cấu trúc từ Ti-plasmid với đoạn DNA đƣợc cắt bỏ hết các gen không cần thiết nhƣ gen onc và gen tổng hợp opine ở giữa hai trình tự LB và RB, gắn thêm một số thành phần tạo cấu trúc mới gồm: Các replicon để DNA plasmid có thể vừa tự nhân bản trong cả E.coli và A. tumefaciens;
các gen chọc lọc, gen chỉ thị và vùng có chứa nhiều điểm cắt của các enzyme giới hạn nằm ở hai trình tự LB và RB để chèn gen mong muốn cần chuyển. (ii) Vector bổ trợ có cấu trúc gồm các gen vir đƣợc tách và đƣợc đƣa vào chung một plasmid đảm
nhiệm chức năng vận chuyển gen vào tế bào thực vật. Plasmid này đƣợc cải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển khối u, nhƣng vẫn duy trì khả năng xâm nhập vào tế bào thực vật. Hai cấu trúc này cùng đƣợc đƣa vào A. tumefaciens, khi các gen trên vector bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T-DNA sang tế bào thực vật.
1.4.4. Các loại gen công cụ sử dụng trong sàng lọc các thể nhận gen
Sau khi biến nạp gen mô tế bào thực vật, không phải tất cả các tế bào trong khôi mô đều nhận đƣợc gen chuyển mà chỉ có một số ít tế bào chấp nhận sự tích hợp của gen chuyển, bởi vậy, cần có cơng cụ để sàng lọc, chọn lọc đƣợc những tế bào đã đƣợc chuyển gen tái sinh thành cây. Một trong những công cụ đắc lực, hữu hiệu để chọn lọc đƣợc tế bào đã đƣợc chuyển gen đó là nhóm gen cơng cụ. Gen công cụ (marker genes) là những gen đƣợc sử dụng làm phƣơng tiện cho việc thực hiện hiệu quả quá trình chuyển gen và tạo cây trồng chuyển gen, nhƣng không tham gia vào việc hình thành tính trạng mới. Các gen công cụ đƣợc chi làm 2 nhóm, nhóm gen cơng cụ làm nhiệm vụ chỉ thị (reporter genes) và nhóm gen chọn lọc tế bào thực vật chuyển gen (selectable marker genes).