M –+ C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C
Chƣơng 4 THẢO LUẬN
THẢO LUẬN
Việt Nam là một trong những quốc gia bị tác động mạnh mẽ của việc biến đổi khí hậu, do đó hạn hán và đất nhiễm mặn hoang hóa đang ngày một gia tăng, đây sẽ là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lƣợng cây trồng nông lâm nghiệp và thu hẹp diện tích đất canh tác. Vì vậy, việc triển khai các nghiên cƣ́u nhằ m ta ̣o ra đƣợc các giống cây trồng nông lâm nghiệp có khả năng chớng chi ̣u đƣợc các điều kiê ̣n bất lợi của môi trƣờng đang là vấn đề cấp bách hiê ̣n nay. Trên thế giới, các nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi chủ yếu tập chung vào nhóm cây nơng nghiệp, cịn nhóm cây lâm nghiệp mới chỉ có một vài cơng trình cơng bố (Yu et al., 2009, Kipkorir et al., 2010; Dibax et al., 2010; Yu et al., 2010) chủ yếu ở cây bạch đàn và cây dƣơng. Trên thế giới, cây dƣơng (Populus sp.) đƣợc sử dụng nhƣ là cây mơ hình lâm nghiệp cho các nghiên cứu thử nghiệm về chuyển gen. Tuy nhiên, hạn chế duy nhất củ a lồi cây này đó là khó sinh trƣ ởng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam. Vì vậy, việc tìm kiếm một lồi cây gỗ dễ thích ứng và đặc hữu ở Việt Nam để làm cây cho hƣớng nghiên cứu chuyển gen trên đối tƣợng cây lâm nghiệp trở nên rất cần thiết.
Cây Xoan ta đƣợc đánh giá là một trong những loài cây lấy gỗ lớn quan trọng trong chiến lƣợc phát triển lâm nghiệp ở nƣớc ta. Cây Xoan ta có mặt ở 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp, trong đó 3 vùng: Vùng Trung tâm, vùng Đồng bằng Sông Hồng và vùng Nam Trung bộ Xoan ta đứng đầu trong danh mục các cây gỗ trồng rừng đƣợc ƣu tiên phát triển. Xoan ta là loài cây gỗ lớn, nhiều tác dụng: gỗ nhẹ, có vân thớ đẹp, khá bền và khó bị mối mọt nên đƣợc dùng trong xây dựng, trang trí nội thất và điêu khắc, lá làm phân xanh, hạt ép lấy dầu. Lồi cây này cũng có một số hợp chất quan trọng là tetranortriterpenoids và limonoids đƣợc sử dụng trong y học (Huang et al., 1996; Itokawa et al., 1995). Đến nay, đã có nhiều cơng trình trong và ngồi nƣớc nghiên cứu về tái sinh cây Xoan ta in vitro (Ahmad et al., 1990;
Thakur et al., 1998; Vila et al., 2003, 2005; Sharry et al., 2006a,b; Bùi Văn Thắng et al., 2007; Đỗ Xuân Đồng et al., 2008; Hồ Văn Giảng et al., 2011). Tuy nhiên, các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc tái sinh in vitro phục vụ cho việc nhân giống vơ tính, chọn lọc biến dị soma. Số lƣợng cơng trình cơng bố về chuyển gen vào cây Xoan ta cịn rất ít. Trên thế giới mới chỉ có duy nhất một cơng trình cơng bố về chuyển gen GFP vào cây Xoan ta (Nirsatmanto & Gyokusen, 2007), ở Việt Nam có một số cơng trình cơng bố về chuyển gen vào cây Xoan ta: Chuyển gen gus và
bar (Bui Van Thang et al., 2007); Chuyển gen 4Cl (Ngo Van Thanh et al., 2010);
Chuyển gen GA20 (Đỗ Xuân Đồng et al., 2011). Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen còn thấp (0,5 – 3%) so với tiềm năng tái sinh hiệu suất cao của cây Xoan ta đã đƣợc báo cáo (Bùi Văn Thắng et al., 2007; Đỗ Xuân Đồng et al., 2008). Để nâng cao hiệu suất biến nạp gen vào cây Xoan ta thông qua Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu khảo sát từng nhân tố ảnh hƣởng trực tiếp đến hiệu suất biến nạp gen. Kết quả đã nâng cao hiệu suất chuyển gen vào cây Xoan ta khi sử dụng đoạn thân cây mầm, nuôi cấy cảm ứng 2 ngày làm thể nhận gen, nồng độ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens OD600nm= 0,5, đồng nuôi cấy 48 giờ và chọn lọc chồi
chuyển gen trên môi trƣờng tái sinh bổ sung 150 mg/l kanamycin, chọn lọc chồi chuyển gen ở giai đoạn ra rễ là 50 mg/l kanamycin. Kết quả cho thấy đối với cây Xoan ta đoạn thân cây mầm 12 ngày tuổi nuôi cấy cảm ứng 2 ngày sử dụng làm thể nhận gen là tốt nhất, sử dụng các chủng A. tumefaciens khác nhau cho hiệu suất chuyển gen vào Xoan ta dao động 13,77 – 18,15%, kết quả này cũng đƣợc báo cáo bởi Nirsatmanto và Gyokusen (2007). So với các loài cây trồng khác, kể cả các lồi cây gỗ, Xoan ta là lồi cây có khả năng kháng rất cao với kháng sinh kanamycin, ở nồng độ 100 mg kanamycin trên lít mơi trƣờng, đoạn thân mầm khơng biến nạp gen vẫn tái sinh chồi (48,2%), bởi vậy việc sử dụng nồng độ 100 mg kanamycin trên lít mơi trƣờng đã khơng chọn lọc hiệu quả chồi chuyển gen (Nirsatmanto & Gyokusen, 2007; Đỗ Xuân Đồng et al., 2011; Hồ Văn Giảng et al., 2011). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định đƣợc nồng độ kanamycin hiệu quả cho chọn lọc chồi Xoan ta chuyển gen là 150 mg/l mơi trƣờng. Quy trình chuyển gen vào Xoan ta tối ƣu
thơng qua Agrobacterium tumefaciens có độ lặp lại cao và ổn định. So với các loài cây gỗ lâm nghiệp khác, kể cả cây dƣơng (một loài cây gỗ làm mơ hình cho chuyển gen) thì Xoan ta là lồi cây dễ tiếp nhận gen ngoại lai, bởi vậy đây đƣợc xem là một mơ hình cây gỗ triển vọng để nghiên cứu chuyển gen ở Việt Nam.
Môi trƣờng cực đoan nhƣ hạn hán, ngập mặn, ngập úng, nhiệt độ cao thƣờng làm mất cân bằng về áp suất thẩm thấu gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng của nhiều loài cây trồng (Linhui et al., 2012). Một trong những phản ứng thƣờng gặp nhất khi cây gặp các điều kiện bất lợi về nƣớc đó là tăng cƣờng tổng hợp và tích lũy các chất chuyển hóa nhƣ các loại đƣờng tan, axít amin, v.v. để tăng cƣờng áp suất thẩm thấu cho tế bào (Hasegava & Bressan, 2000). Proline và glycine betaine đƣợc biết đến là một trong những chất đóng vài trị quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào khi thực vật sống trong các điều kiện bất lợi nhƣ hạn, mặn, lạnh, nóng (Solomon et al., 1994). Các con đƣờng liên quan đến sinh tổng hợp proline đến nay đã đƣợc làm sáng tỏ. Ở thực vật, quá trình sinh tổng hợp proline đƣợc kiểm sốt bởi hoạt tính của hai gen mã hóa cho enzyme P5CS. Hai gen này có độ tƣơng đồng rất cao về trình tự mã hóa nhƣng biểu hiện lại rất khác nhau trong những điều kiện khác nhau (Armengaud et al., 2004). Ở cây Arabidopsis, gen P5CS2 là một gen “chủ chốt” hoạt động của gen này chủ yếu ở các mô phân sinh nhƣ đầu rễ và đỉnh chồi, ở hoa và các tế bào nuôi cấy (Székely et al., 2008). Cả hai gen P5CS đều hoạt động ở các mô phân sinh của hoa chủ yếu để cung cấp proline cho quá trình phát triển của hoa (Mattioli et al., 2009). Gen P5CS1 của cây Arabidopsis
hoạt động rất mạnh và đƣợc cảm ứng bởi các yếu tố bất lợi về thẩm thấu và nó cũng đƣợc hoạt hóa bởi acid abscisic (ABA). Ngồi ra, hoạt động của gen này và sự tích lũy proline cũng bị kích thích bởi ánh sáng và bị ức chế bởi các hợp chất brassinosteroid (Hayashi et al., 2000; Abrahám et al., 2003). Các nhà khoa học đã phân lập đƣợc các gen: P5CS, P5CR, P2CR, α-OAT mã hóa cho các enzyme
tham gia vào chu trình sinh tổng hợp proline ở thực vật. Các gen này đã đƣợc thiết kế với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng. Các loài cây trồng biến đổi các gen này đã đƣợc chứng
minh là tăng cƣờng đƣợc khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣ hạn, mặn, lạnh, băng giá và tác nhân oxy hóa.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chuyển gen P5CSm (đột biến loại bỏ
hiệu ứng ức chế phản hồi ngƣợc) dƣới sự điều khiển đặc hiệu của promoter rd29A cảm ứng hạn vào Xoan ta. Kết quả cho thấy các dòng Xoan ta chuyển gen
P5CSm tăng cƣờng sinh tổng hợp và tích lũy hàm lƣợng proline cao (tăng 3,04 –
5,79 lần, tƣơng ứng tăng từ 0,279 lên 0,850 mg/g lá tƣơi và tăng từ 0,318 lên 1,842 mg/g lá tƣơi) trong điều kiện môi trƣờng bị khô hạn giúp cây chuyển gen chống chịu với điều kiện khô hạn tốt hơn cây đối chứng không chuyển gen (hàm lƣợng proline tăng 1,89 lần, tƣơng ứng tăng từ 0,247 lên 0,468 mg/g lá tƣơi). Ở điều kiện xử lý bởi hạn nhân tạo 10 ngày khơng tƣới nƣớc, hai dịng Xoan ta PX24 và PX30 chuyển gen sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng, ngƣợc lại dịng Xoan ta đối chứng không chuyển gen lá bị héo rủ, rụng và ngừng sinh trƣởng. Kết quả tƣơng tự cũng đã đƣợc báo cáo, cây lúa chuyển gen P5CS tăng cƣờng khả năng chịu hạn và mặn (Zhu et al., 1998; Su et al., 2004), cây Chanh chuyển gen P5CSF129 (đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi ngƣợc ở vị trí 129A) sinh trƣởng, phát triển tốt ở điều kiện hạn (Molinari et al., 2004); cây thuốc lá chuyển gen P5CSm (đột biến
loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi phản hồi ngƣợc) dƣới sự điều khiển đặc hiệu của promoter rd29A tăng cƣờng khả năng chịu hạn (Nguyễn Thị Thúy Hƣờng et al., 2010).
Thuốc lá là cây trồng đầu tiên đƣợc chuyển gen P5CS phân lập từ cây nho đƣợc điều khiển bởi promoter 35S. Phân tích các dịng thuốc lá chuyển gen này cho thấy hoạt động của enzyme P5CS rất mạnh và hàm lƣợng proline tích lũy tăng lên từ 10 - 18 lần so với cây đối chứng khơng chuyển gen. Tăng cƣờng tích lũy proline ở các dịng thuốc lá này cịn kích thích sự phát triển của sinh khối rễ khi cây bị xử lý mặn. Do hàm lƣợng proline tăng lên rất mạnh ở các dòng thuốc lá chuyển gen nên kết quả này cho thấy hoạt tính của enzyme P5CS giữ vai trị quyết định trong chu trình sinh tổng hợp proline ở thực vật. Đặc biệt hơn, khi bổ
sung thêm nitơ vào môi trƣờng nuôi cấy các dịng thuốc lá này thì hàm lƣợng proline tăng lên đáng kể so với dịng thuốc lá chuyển gen ni trên mơi trƣờng khơng đƣợc bổ sung nitơ (Kavi Kishor et al., 1995). Những nghiên cứu về enzyme P5CS tinh sạch từ cây đậu xanh cũng cho thấy enzyme này bị ảnh hƣởng bởi hiệu ứng ức chế phản hồi ngƣợc của proline và hoạt tính của enzyme này giảm tới 50% khi bổ sung 5 mM proline ngoại bào (Hu et al., 1992).
Nghiên cứu trên cây Arabidopsis các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc
mối quan hệ chặt chẽ giữa hoạt động của enzyme P5CS và sự tích lũy proline trong điều kiện cây bị stress về thẩm thấu (Savoure et al., 1995); Sự xuất hiện hiệu ứng ức chế phản hồi ngƣợc của proline tới hoạt tính của enzyme P5CS cũng bị ảnh hƣởng dƣới các điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Khi chuyển gen P5CS đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi ngƣợc bởi proline vào cây thuốc lá, kết quả các dòng thuốc lá chuyển gen P5CS đột biến tăng cƣờng tích lũy proline
nhiều hơn gấp 2 lần so với các dòng thuốc lá chuyển gen P5CS kiểu dại tách từ
cây V. aconitifolia (Kavi Kishor et al., 1995; Zhang et al., 1995). Thêm vào đó, khi xử lý các dòng thuốc lá chuyển gen P5CS đột biến với 200 mM NaCl thì kích thích sự tích lũy proline. Tƣơng tự, loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngƣợc đối với enzyme P5CS, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng và đtg (2010) đã chứng minh cây thuốc lá chuyển gen P5CSm đột biến dƣới sự điều khiển của promoter rd29A chống
chịu tốt hơn rõ rệt so với cây đối chứng không chuyển gen ở điều kiện gây hạn nhân tạo. Phân tích hàm lƣợng proline cho thấy các dòng thuốc lá chuyển gen
P5CS đột biến tích lũy proline ở mức độ cao hơn hẳn so với cây đối chứng
không chuyển gen. Những kết quả này là dẫn chứng rất rõ ràng rằng hiệu ứng ức chế phản hồi ngƣợc enzyme P5CS bởi proline giữ vai trò rất quan trọng đối với quá trình sinh tổng hợp proline của thực vật trong cả điều kiện bình thƣờng và điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu.
Ngoài gen P5CS chuyển vào cây trồng tăng cƣờng sinh tổng hợp proline, các nhà khoa học còn chuyển các gen cũng tham gia vào sinh tổng hợp proline giúp cây trồng chịu tốt với điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Cây Đậu tƣơng chuyển gen
P5CR tăng cƣờng tổng hợp và tích lũy proline giúp cây chịu nhiệt và chịu hạn (De
Ronde et al., 2004), cây Arabidopsis chuyển gen PRODH tăng cƣờng tổng hợp và
tích lũy proline giúp cây chịu băng giá và mặn (Nanjo et al., 1999), cây lúa và thuốc lá chuyển gen δ-OAT giúp cây chịu hạn và mặn tốt hơn so với cây đối chứng không chuyển gen (Roosens et al., 2002; Wu et al., 2003).
Để tạo đƣợc giống cây trồng chuyển gen biểu hiện hiệu quả ở các điều kiện môi trƣờng khác nhau, các nhà nghiên cứu thƣờng quan tâm đến đoạn DNA điều khiển (promoter) vì đây là nhân tố cần thiết và quyết định đến quá trình khởi động phiên mã biểu hiện gen. Một số promoter đã đƣợc sử dụng nhiều trong chuyển gen nhƣ 35S, ubiquitin,… các promoter này thƣờng biểu hiện mạnh không đặc hiệu. Để gen P5CSm biểu hiện hiệu quả trong cây Xoan ta chuyển gen. Trong nghiên cứu
này, chúng tôi sử dụng promoter rd29A để điều khiển biểu hiện gen P5CSm.
Promoter rd29A trong hệ gen của loài cây Arabidopsis thaliana đƣợc xác định liên
quan đến sự điều hòa hoạt động của các gen trong điệu kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣ hạn, nhiệt độ thấp và nồng độ muối cao. Một số nghiên cứu đã phát hiện đƣợc trình tự promoter rd29A chứa 2 vùng có hoạt tính cis là vùng cảm ứng ABA
(ABRE) và vùng cảm ứng mất nƣớc (DRE)/C repeat (CRT). Cả 2 vùng đều liên quan đến sự điều hòa hoạt động của các gen trong điệu kiện bất lợi của môi trƣờng. Hoạt động đặc hiệu của promoter rd29A cảm ứng hạn đã đƣợc nghiên cứu chứng
minh ở nhiều loài cây trồng nhƣng chủ yếu ở nhóm cây thân thảo nhƣ cây lúa mì, khoai tây, mía, thuốc lá (Gao et al., 2005; Zhang et al., 2005; Wu et al, 2008; Nguyễn Thị Thuý Hƣờng et al., 2010). Kết quả tƣơng tự, cây Xoan ta chuyển gen
gus dƣới sự điều khiển của promoter rd29A cho thấy hoạt tính enzyme GUS của các
mẫu Xoan ta chuyển gen sau xử lý bởi hạn nhân tạo tăng gấp 5-8 lần so với các mẫu trƣớc xử lý bởi hạn nhân tạo. Kết quả này chỉ ra rằng promoter rd29A cũng hoạt
động rất đặc hiệu khi điều kiện môi trƣờng bị hạn ở cây Xoan ta chuyển gen.
Ngoài hƣớng tiếp cận tạo các giống cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng bằng cách chuyển các gen tham gia
vào sinh tổng hợp proline, một hƣớng tiếp cận khác cũng đƣợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, đó là hƣớng tạo cây trồng chuyển gen tăng sinh tổng hợp glycine betaine, một chất hịa tan tƣơng tích hiệu quả giúp cây chống chịu tốt với các điều kiện liên quan đến áp suất thẩm thấu của tế bào (điều kiện mất nƣớc). Trong tế bào thực vật, glycine betain đƣợc tổng hợp thông qua một chuỗi gồm hai phải ứng từ choline đƣợc xúc tác bởi hai enzyme: choline monooxygenase (CMO) và betain aldehyde dehydrogenase (BADH) (Rathinasbapathi et al. 1997). Cũng giống nhƣ thực vật bậc cao, ở vi khuẩn E. coli và ở một số động vật, con đƣờng sinh tổng hợp GB cũng trải qua hai bƣớc là khử choline thành betaine aldehyde và oxy hóa betaine aldehyde thành GB. Tƣơng ứng, hai bƣớc đó đƣợc xúc tác bởi choline dehydrogenase (CDH) và betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) (Takabe et al. 1998). Ngƣợc lại, con đƣờng sinh tổng hợp GB ở một số vi khuẩn nhƣ Arthrobacter
globiformis và Arthrobacter panescens lại rất đơn giản, từ choline chuyển hóa thành
sản phẩm trực tiếp là glycine betaine chỉ cần xúc tác bởi choline oxydase (Ikuta et al. 1977). Từ những hiểu biết sâu sắc về con đƣờng sinh tổng hợp glycine betaine ở sinh vật. Các nhà khoa học đã phân lập đƣợc gen codA mã hóa cho choline oxydase từ vi khuẩn Arthrobacter globiformis, thiết kế vector chuyển gen mang gen codA
dƣới sự điều khiển của promoter 35S, chuyển vào nhiều loài cây trồng và chứng minh cây trồng chuyển gen tăng cƣờng sinh tổng hợp GB nâng cao khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng (Hayashi et al., 1998; Waditee et al., 2005; Ahmad et al., 2008; Yu et al., 2009 ). Cùng với hƣớng nghiên cứu này, nhƣng chúng tôi tiếp cận theo một hƣớng khác là không phân lập gen codA từ Arthrobacter
globiformis mà tiến hành tổng hợp nhân tạo gen codA dựa trên trình tự gốc cơng bố
trên Ngân hàng gen NCBI (AY304485). Việc tổng hợp nhân tạo gen codA cho phép thay đổi một số bộ ba mã hóa axit amin phổ biến trên trình tự gen ở vi khuẩn nhƣng