VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5.1. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen bằng PCR
Thu lá cây Xoan ta, thuốc lá chuyển gen và đối chứng ở giai đoạn cây con trồng trong nhà lƣới sau 2 tuần. Tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp CTAB của Collins và Symons (1992). DNA tổng số đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
i) Kiểm tra cây Xoan ta chuyển promoter rd29A::gus và rd29A::P5CSm bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu rd29AF (5’-CCC AAG CTT ATC ATG TTA GCG TCA GAT A-3’) và rd29AR (5’-CGG GAT CCT CCA ATA GAA GTA ATC AAA C-3’), theo chu trình nhiệt nhƣ sau: 94oC/5 phút; 35 chu kì [94oC/1 phút, 58oC/45 giây, 72oC/1 phút 30 giây]; 72oC/10 phút và kết thúc phản ứng ở 4oC. Thành phần phản ứng nhƣ bảng 2.8.
Bảng 2.8: Thành phần phản ứng PCR nhân promoter rd29A STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc khử ion 14,5 2 Đệm PCR 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,5 4 dNTPs (10 mM) 2,0 5 Mồi xuôi (10 pM) 1,0 6 Mồi ngƣợc (10 pM) 1,0 7 DNA tổng số (50 ng/µl) 1,0
8 Taq polymerase (5u/µl) 0,5
Tổng 25
ii) Kiểm tra cây Thuốc lá, Xoan ta chuyển TP-codA bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu F/TP-XbaI và R/CMYC-SacI thực hiện theo chu kỳ nhiệt độ nhƣ sau: 94oC/3 phút; 30 chu kì [94oC/1 phút, 55oC/50 giây, 72oC/1 phút 30 giây]; 72oC/10 phút và kết thúc phản ứng ở 4oC. Thành phần phản ứng nhƣ bảng 2.8.
iii) Kiểm tra cây Thuốc lá chuyển gen codA bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu F/CODA- XbaI và R/CMYC-SacI thực hiện theo chu kỳ nhiệt độ nhƣ sau: 94oC/3 phút; 30 chu kì [94oC/1 phút, 58oC/50 giây, 72oC/1 phút 30 giây]; 72oC/10 phút và kết thúc phản ứng ở 4oC. Thành phần phản ứng nhƣ bảng 2.8.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên agarose 0,8%, nhuộm và chụp ảnh.