VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.4. Tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen
i) Biến nạp vector vào A. tumefaciens
Quy trình biến nạp bằng xung điện đƣợc thực hiện nhƣ sau: (1) Tế bào khả biến A. tumefaciens LBA4404 đƣợc đặt trong đá 5 phút, sau đó bổ sung 1 µl vector và trộn nhẹ. (2) Chuyển hỗn hợp dung dịch vào cuvet. (3) Xung điện ở 2,5 kv, 25 µF, 400 sau đó đặt ngay vào đá, sau 5 phút bổ sung 1 ml môi trƣờng LB lỏng. (4)
200 µl dung dịch khuẩn lên đĩa mơi trƣờng LB đặc bổ sung 50 mg/l kanamycin và 50 mg/l rifamycin, nuôi ở 28oC trong 48 -72 giờ.
ii) Chọn dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp
Chọn dòng vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp bằng cách tách chiết plasmid, kiểm tra bằng phản ứng PCR nhƣ trình bày ở mục 2.2.1.3. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 chứa vector chuyển gen pBI121::TP-codA, pBI121::codA sau khi chọn lọc đƣợc giữ chủng ở - 80oC, làm vật liệu chuyển gen.
2.2.2. Xây dựng và tối ƣu quy trình chuyển gen vào Xoan ta bằng Agrobacterium Bảng 2.6: Môi trƣờng nuôi và cho ̣n lo ̣c cây Xoan ta chuyển gen Bảng 2.6: Môi trƣờng nuôi và cho ̣n lo ̣c cây Xoan ta chuyển gen
(Bùi Văn Thắng et al., 2007b)
STT Môi trƣờng Ký hiệu Thành phần môi trƣờng
1 Gieo hạt tạo cây mầm
SM
MS + 30 g/l sucrose + 8,0 g/l agar, pH = 5,8. 2 Nuôi cấy cảm ứng PreM
MS + 1,0 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 30g/l sucrose + 8,0 g/l agar, pH = 5,8. 3 Đồng nuôi cấy CoM MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 200 µM AS + 30 g/l sucrose + 8,0 g/l agar, pH = 5,8.
4 Tái sinh chồi
chọn lọc SSM
MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin + 30 g/l sucrose + 8,0 g/l agar + (0-200 mg/l) kanamycin + 300 mg/l cefotaxime, pH = 5,8.
5
Chọn lọc cây chuyển gen
(Ra rễ)
PSM MS + 0,3 mg/l IBA + 20 g/l sucrose + 8,0 g/l agar + (0-100 mg/l) kanamycin, pH = 5,8.