M –+ C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C
3.3.1. Tạo dòng cây Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSm
Gen P5CSm dƣới sự điều khiển của promoter cảm ứng hạn rd29A đƣợc
chuyển vào đoạn thân mầm Xoan ta thông qua A. tumefaciens. Các dòng chồi
chuyển gen đƣợc tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc SSM (MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin + 150 mg/l kanamycin + 300 mg/l cefotaxime + 30 g/l sucrose + 8,0 g/l agar) và cho ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc PSM (MS + 0,3 mg/l IBA + 50 mg/l kanamycin + 30 g/l sucrose + 8,0 g/l agar). Chỉ có những cây mang cấu trúc gen chuyển mới có thể sống và ra rễ. Với 3 lơ thí nghiệm chuyển cấu trúc gen
rd29A::P5CSm vào Xoan ta thu đƣợc 72 dòng cây Xoan ta ra rễ trên môi trƣờng
chọn lọc (bảng 3.9). Các dòng cây Xoan ta này đƣợc chuyển ra trồng trong nhà lƣới. Khi cây sinh trƣởng bình thƣờng (ra lá mới), lá của 72 dòng cây Xoan ta chuyển gen và dịng cây đối chứng khơng chuyển gen (WT) đƣợc thu và tách chiết DNA tổng số, sử dụng cho sàng lọc bằng PCR. Kết quả cho thấy, cả 72 dòng cây Xoan ta kiểm tra đều dƣơng tính với phản ứng PCR, các dòng chuyển gen đều xuất hiện một băng DNA có kích thƣớc 1,29 kb đúng với kích thƣớc của đoạn promoter rd29A.
Điều này chứng tỏ các dòng Xoan ta này đã đƣợc chuyển cấu trúc gen rd29A::P5CSm.
Bảng 3.9: Kết quả tạo dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm
Lơ thí nghiệm Số mẫu biến nạp Số chồi tái sinh/môi trƣờng SSM Số chồi ra rễ/ môi trƣờng R Tổng chồi ra rễ (PCR +) 1 200 113 28 2 150 68 24 72 3 150 75 20
Hình 3.8: Các dịng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm.
a và b: chồi Xoan ta chuyển gen tái sinh trên mơi trường có 150 mg/l kanamycin; c: chồi Xoan ta chuyển gen ra rễ trên mơi trường có 50 mg/l kanamycin; d: các dịng Xoan ta
chuyển gen trồng ở nhà lưới 1 tháng tuổi.