VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.3. Tạo vector chuyển gen pBI121 mang gen TP-codA và codA
i) Cắt vector pBI121, gen TP-codA và codA bằng enzyme giới hạn
Gen và vector đƣợc cắt bằng cùng một cặt enzyme XbaI và SacI có thành phần phản ứng nhƣ bảng sau: Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt gen và vector STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 18 2 Buffer Tango 10X 4 3 XbaI (1U/µl) 4 4 Sac I (1U/µl) 4
5 Vector pBI121 hoặc TP-codA
hoặc codA đã tinh sạch 10
Tổng 40
Phản ứng cắt đƣợc ủ ở 37oC trong ít nhất 3 giờ. Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% và thôi gel (nhƣ mục 2.2.1.2 ii).
ii) Ghép nối gen vào vector chuyển gen pBI121
Sản phẩm thôi gel vector pBI121 và gen TP-codA, codA đƣợc ghép nối với nhau để tạo plasmid tái tổ hợp nhờ T4 DNA ligase, thành phần phản ứng nhƣ bảng sau:
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng ghép nối gen với vector pBI121
STT Thành phần phản ứng Thể tích(µl)
1 H2O deion 6
2 Vector pBI121 mở vòng 5
3 Gen TP-codA hoặc codA 5
4 T4 DNA ligase Buffer 10X 2
5 T4 DNA ligase (1U/µl) 2
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 22oC trong 90 phút. Sau đó đặt hỗn hợp phản ứng lên đá lạnh và tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.
iii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau: (1) Bổ sung 5 µl sản phẩm ghép nối vào ống đựng tế bào khả biến E.coli DH5α đã làm tan đá, trộn nhẹ bằng tay sau đó ủ
trong đá lạnh 30 phút. (2) Sốc nhiệt tế bào ở 42o
C trong 1 phút và chuyển ngay vào đá lạnh, để ổn định 5 phút. (3) Bổ sung 200 µl mơi trƣờng LB lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 37oC trong 1 giờ. (4) Cấy trải 100 µl dung dịch biến nạp lên đĩa mơi trƣờng LB đặc bổ sung 50 mg/l kanamycin, nuôi ở 37o
C trong khoảng 14 -16 giờ để khuẩn mọc thành khuẩn lạc.
iv) Chọn dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp bằng colony – PCR
Chọn 10 khuẩn lạc để chạy phản ứng colony – PCR để xác định khuẩn lạc có mang vector tái tổ hợp chứa gen mong muốn. Thành phần phản ứng PCR tƣơng tự nhƣ mục 2.2.1.2 chỉ khác là mẫu DNA đƣợc thay bằng khuẩn lạc.
Phản ứng colony - PCR cặp mồi F/TP-XbaI và R/CMYC-SacI thực hiện theo chu kỳ nhiệt độ nhƣ sau: 94oC/3 phút; 30 chu kì [94oC/1 phút, 55oC/50 giây, 72oC/1 phút 30 giây]; 72oC/10 phút và kết thúc phản ứng ở 4oC.
Phản ứng PCR nhân gen codA bằng cặp mồi F/CODA- XbaI và R/CMYC- SacI thực hiện theo chu kỳ nhiệt độ nhƣ sau: 94oC/3 phút; 30 chu kì [94oC/1 phút, 58oC/50 giây, 72oC/1 phút 30 giây]; 72oC/10 phút và kết thúc phản ứng ở 4oC.
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% để chọn khuẩn lạc mang gen có kích thƣớc nhƣ mong muốn.
v) Tách chiết plasmid tái tổ hợp
Sử dụng Plasmid Extraction Kit (Bioneer) để tách chiết plasmid đối với khuẩn lạc có sản phẩm colony – PCR dƣơng tính. Quy trình tách chiết nhƣ sau: (1) Hút 2 ml dung dịch vi khuẩn và ly tâm 8000 v/p trong 5 phút để thu cặn tế bào. (2) Bổ sung 250 µl dung dịch RS, vortex để phá vở tế bào. (3) Bổ sung 250 µl dung
dịch BL và trộn nhẹ bằng tay sau đó bổ sung 350 µl dung dịch NE và đảo ống ngay lập tức để tránh kết tủa cục bộ. (4) Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút, 4oC, hút dịch chuyển lên cột. (5) Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. (6) Bổ sung 500 µl dung dịch DE vào cột, ủ 5 phút, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. (7) Bổ sung 500 µl dung dịch WB, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung thêm 1 phút để loại bỏ hết dung dich WB. (8) Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml. (9) Hòa tan DNA trong 50 µl nƣớc khử ion, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, lấy dịch. (10) Điện di kiểm tra plasmid trên gel agarose 0,8%.
vi) Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn
Chọn 2 mẫu plasmid tái tổ hợp để cắt kiểm tra theo thành phần phản ứng nhƣ bảng sau:
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 9 2 Buffer Tango 10X 2 3 XbaI (1U/µl) 2 4 Sac I (1U/µl) 2 5 Plasmid tái tổ hợp 5 Tổng 20
Phản ứng cắt đƣợc ủ ở 370C trong ít nhất 3 giờ. Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm cắt đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.