M –+ C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C
Transit peptide TP
3.4.2.4. Đánh giá hoạt động của cấu trúc gen TP-codA/codA trên cây thuốc lá
a) Tạo các dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA và codA
Trong chuyển gen thực vật, cây thuốc lá đƣợc xem xét nhƣ là loại cây mơ hình phục vụ cho các nghiên cứu đánh giá chức năng gen bởi vì hệ thống tái sinh và tiếp nhận gen ngoại lai của cây thuốc rất hiệu quả, thời gian phân hóa từ mơ đến tạo cây hoàn chỉnh khá ngắn, mặt khác cây thuốc lá là cây ngắn ngày, rễ trồng và chăm sóc nên dễ dàng thu đƣợc hạt để nghiên cứu các thế hệ tiếp theo. Bởi vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi chọn cây thuốc lá làm cây mơ hình để đánh giá hai cấu trúc vector chuyển gen thiết kế (pBI12::TP-codA và pBI121::codA), từ đó sẽ lựa chọn đƣợc cấu trúc gen thích hợp để chuyển vào cây Xoan ta.
M 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 2.0 kb 1.5 kb 2.0 kb 1.5 kb 1.9 kb 1.7 kb (a) (b)
Bảng 3.11: Kết quả chuyển gen TP-codA/codA vào thuốc lá Gen Lơ thí nghiệm Số mảnh lá biến nạp Số cụm chồi/MT tái sinh + 100 mg/l Kan Số chồi cấy/MT ra rễ + 50 mg/l Kan Số chồi ra rễ 1 30 112 60 46 TP-codA 2 50 185 86 71 3 30 97 52 38 Tổng số 110 394 198 155 1 35 95 48 40 codA 2 30 125 70 59 3 42 105 68 61 Tổng số 107 325 186 160
Sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang vector chuyển gen nhị thể pBI121::TP-codA và A. tumefaciens LBA4404 mang vector nhị thể pBI121::codA chuyển gen vào mảnh lá thuốc lá giống K326. Kết quả thu đƣợc nhƣ bảng 3.11 cho thấy, sau 3 lần thí nghiệm chuyển cấu trúc gen TP-codA vào 110
mảnh lá thuốc lá thu đƣợc 394 cụm chồi tái sinh trên mơi trƣờng có 100 mg/l kanamycin, chọn lọc 198 chồi sinh trƣởng, phát triển tốt (có thân, lá xanh đậm) cấy chuyển sang mơi trƣờng ra rễ chọn lọc có 50 mg/l kanamycin thu đƣợc 155 chồi ra rễ. Tƣơng tự, chuyển gen codA vào 107 mảnh lá thu đƣợc 325 cụm chồi tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc, chọn 186 chồi cấy chuyển sang môi trƣờng ra rễ chọn lọc thu đƣợc 160 chồi ra rễ. Ngƣợc lại, mảnh lá thuốc lá không đƣợc chuyển gen cấy chuyển lên môi trƣờng chọn lọc có 100 mg/l kanamycin (làm đối chứng), 100% mẫu bị chết không tái sinh chồi. Điều này cho thấy các dòng thuốc lá tái sinh và ra rễ trên mơi trƣờng chọn lọc là các dịng đã đƣợc chuyển gen.
Hình 3.24: Mảnh lá chuyển gen tái sinh trên MT có 100 mg/l kanamycin sau 3 tuần.
a: chuyển gen TP-codA; b: chuyển gen codA; c: không chuyển gen (đối chứng).
a1 1 1
Hình 3.26: Chồi thuốc lá ni trên mơi trƣờng ra rễ có 50 mg/l kanamycin.
a2, b2: Chồi chuyển gen; c2: Chồi không chuyển gen (đối chứng)
Để kiểm tra chắc chắn các dịng thuốc lá ra rễ đƣợc trên mơi trƣờng có kháng sinh chọn lọc là các dịng chuyển gen. Chúng tơi chọn ngẫu nhiên 10 dòng thuốc lá ra rễ chuyển gen TP-codA, 10 dòng thuốc lá ra rễ chuyển gen codA và 1 dịng đối
chứng khơng chuyển gen, thu lá tách chiết DNA tổng số làm khuôn cho phản ứng PCR. Sử dụng cặp mồi đặc hiệu F/TP-XbaI và R/CMYC-SacI nhân gen TP-codA
bằng PCR. Kết quả sản phẩm PCR thu đƣợc cho thấy cả 10 dòng thuốc chuyển gen
TP-codA đều xuất hiện một băng DNA đặc hiệu có kích thƣớc khoảng 1,9 kb tƣơng
ứng với băng DNA xuất hiện ở mẫu đối chứng dƣơng (plasmid pBI121::TP-codA) và thang DNA chuẩn 1 kb; mẫu đối chứng âm (dịng khơng chuyển gen) khơng xuất hiện băng DNA (hình 3.27).
a2 b2 c2
Hình 3.25: Cụm chồi tái sinh từ mảnh lá trên MT có 100 mg/l kanamycin sau 5 tuần.
a1: chuyển gen TP-codA; b1: chuyển gen codA; c1: khơng chuyển gen (đối chứng).
Hình 3.27: Sản phẩm PCR nhân gen TP-codA từ cây thuốc lá chuyển gen
M: thang DNA 1 kb; (-): cây khơng chuyển gen; (+): plasmid pBI121::TP-codA; 1-10: các dịng thuốc lá chuyển gen TP-codA.
Tƣơng tự, với cặp mồi đặc hiệu F/CODA-XbaI và R/CMYC-SacI nhân gen
codA, sản phẩm PCR cũng cho kết quả cả 10 dòng thuốc lá chuyển gen codA xuất
hiện một bằng DNA có kích thƣớc khoảng 1,7 kb tƣơng ứng với băng DNA xuất hiện ở mẫu đối chứng dƣơng (plasmid pBI121::codA), mẫu đối chứng âm không xuất hiện băng DNA (hình 3.28). Kết quả này cho thấy các dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA và codA ra rễ trên mơi trƣờng chọn lọc có 50 mg/l kanamycin là các
dịng đã đƣợc chuyển gen.
Hình 3.28: Sản phẩm PCR nhân gen codA từ cây thuốc lá chuyển gen
M: thang DNA 1 kb; (-): cây không chuyển gen; (+): plasmid pBI121::codA; 1-10: các dòng thuốc lá chuyển gen codA.
b) Sàng lọc khả năng chịu mặn của dòng thuốc lá chuyển gen trong in vitro
Các dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA và codA đƣợc nuôi cấy trên môi
trƣờng ra rễ bổ sung thêm 200 mM NaCl. Từ 155 dòng thuốc lá chuyển gen TP- codA cấy trên môi trƣờng bổ sung muối, sau 3 tuần thu đƣợc 28 chồi ra rễ chiếm
18,06%; 127 dịng cịn lại khơng ra rễ, lá bị bạch tạng do mất diệp lục (cây ngừng sinh trƣởng và chết). Tƣơng tự, trong 160 dòng thuốc lá chuyển gen codA thu đƣợc 34 dòng ra rễ trên mơi trƣờng bổ sung muối; 126 dịng cịn lại không ra rễ và chết. Ngƣợc lại, 100% chồi của dịng thuốc lá khơng chuyển gen (WT) bị chết khi nuôi cây trên môi trƣờng bổ sung 200 mM NaCl sau 3 tuần (bảng 3.12).
M (-) (+) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Bảng 3.12: Dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA/codA ra rễ trên mơi trƣờng 200 mM NaCl Gen Số dịng thí nghiệm Số dòng chết (lá mất diệp lục) Số dòng ra rễ Tỉ lệ (%) TP-codA 155 127 28 18,06 codA 160 126 34 21,25 cây WT 15 15 0 0,00
Trong các dòng thuốc lá chuyển gen ra rễ trên môi trƣờng bổ sung muối, nhiều dòng lá cũng bị bạch tạng (mất diệp lục). Các dịng thuốc lá chuyển gen TP-
codA có lá xanh đậm hơn, sinh trƣởng tốt hơn so với các dịng thuốc lá chuyển gen codA (hình 3.29 và 3.30). Từ kết quả sàng lọc sơ bộ cho thấy các dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA ra rễ, sinh trƣởng bình thƣờng có lá xanh đậm là các dòng
chuyển gen triển vọng chịu mặn tốt.
Hình 3.29: Các dịng thuốc lá chuyển gen TP-codA và khơng chuyển gen trên mơi trƣờng
ra rễ có 200 mM NaCl.
a: dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA; b, c: dịng thuốc lá khơng chuyển gen (WT).
Hình 3.30: Các dịng thuốc lá chuyển gen codA trên mơi trƣờng ra rễ có 200 mM NaCl.
Để kiểm chứng một lần nữa các dịng thuốc lá chuyển gen TP-codA/codA ra rễ trên mơi trƣờng muối (200 mM NaCl) có khả năng chịu mặn tốt hơn so với đối chứng khơng chuyển gen. Chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm thử khả năng tái sinh chồi từ mảnh lá của cây thuốc lá chuyển gen TP-codA/codA và dịng đối chứng khơng chuyển gen (WT) trên môi trƣờng tái sinh chồi bổ sung 200 mM NaCl. Kết quả sau 5 tuần nuôi cấy, các mảnh lá của cây thuốc lá chuyển gen TP-codA và codA có khả năng tái sinh chồi bình thƣờng trên mơi trƣờng bổ sung 200 mM NaCl; trong khi đó các mảnh lá của cây khơng chuyển gen (WT) bị mất diệp lục và khơng tái sinh chồi (hình 3.31). Kết quả này, một lần nữa cho thấy rằng dịng thuốc lá chuyển gen TP-codA và codA có khả năng chịu mặn tốt hơn so với dịng khơng chuyển gen.
Hình 3.31: Mảnh lá thuốc lá tái sinh trên mơi trƣờng có 200 mM NaCl.
a: dịng chuyển gen TP-codA, b: dịng chuyển gen codA, c: dịng khơng chuyển gen (WT).
c) Đánh giá khả năng chịu mặn của dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA/codA
Chọn 3 dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA (ký hiệu TPC-To1, TPC-To12 và TPC-To23) và 3 dòng thuốc lá chuyển gen codA (ký hiệu C-To3, C-To5 và C-
To17), đây là các dịng có triển vọng chịu mặn tốt nhất từ kết quả nghiên cứu trình bày ở trên. Các dòng này đƣợc nhân nhanh chồi, cho ra rễ và đƣa ra trồng trong chậu đất, sau 10 ngày trồng trên giá thể, cây thích nghi, sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng (hình 3.32) bắt đầu xử lý mặn ở các nồng độ muối NaCl khác nhau (100 mM, 200 mM và 300 mM).
Hình 3.32: Các dịng thuốc lá chuyển gen và đối chứng trồng trên giá thể NT1 sau 10
ngày ở nhà lƣới (trƣớc xử lý mặn).
Kết quả xử lý mặn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA/codA và đối chứng không chuyển gen (WT) cho thấy, ở cả 3 công thức xử lý mặn (100 mM, 200 mM và 300 mM) các dòng thuốc lá chuyển gen TP-codA/codA cây sinh trƣởng và phát triển tốt hơn so với dịng đối chứng khơng chuyển gen (WT). Ở nồng độ 100 mM NaCl, các dòng chuyển gen TP-codA sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng giống với lơ khơng xử lý mặn. Đặc biệt ở công thức xử lý 300 mM NaCl dòng WT bị chết, ngƣợc lại các dòng chuyển gen TP-codA/codA cây vẫn sống nhƣng tốc độ sinh trƣởng chậm lại (hình 3.33). So sánh sinh trƣởng giữa dòng chuyển gen TP- codA và codA nhận thấy các dòng chuyển gen TP-codA sinh trƣởng tốt hơn các
dòng chuyển gen codA trên cùng một cơng thức thí nghiệm (bảng 3.13).
Bảng 3.13: Sinh trƣởng của dịng thuốc lá chuyển gen và WT trên mơi trƣờng xử lý
NaCl ở các nồng độ khác nhau
Dòng Chiều cao cây sau 3 tháng (cm)
0 mM NaCl 100 mM NaCl 200 mM NaCl 300 mM NaCl
WT 62,9 ± 2,25 26,0 ± 2,43 15,7 ± 0,85 - TPC-To1 64,1 ± 4,26 61,9 ± 6,27 48,5 ± 2,05 25,1 ± 5,26 TPC-To12 63,8 ± 2,57 64,3 ± 3,88 52,1 ± 3,87 31,4 ± 4,58 TPC-To23 63,7 ± 3,61 62,4 ± 5,30 50,8 ± 5,87 28,5 ± 5,27 C-To3 63,6 ± 2,82 52,6 ± 7,09 44,8 ± 3,12 24,1 ± 4,63 C-To5 63,0 ± 4,15 50,6 ± 6,73 40,8 ± 6,55 21,7 ± 4,37 C-To17 60,5 ± 4,40 56,4 ± 3,39 47,7 ± 6,45 26,6 ± 4,30
Hình 3.33: Dòng thuốc lá chuyển gen (TPC-To12) và đối chứng không chuyển gen (WT)
sinh trƣởng trên môi trƣờng xử lý NaCl nồng độ khác nhau sau 3 tháng.
Phân tích về hình thái lá, hàm lƣợng diệp lục tổng số của các dòng thuốc lá chuyển gen và dòng WT khi xử lý muối cho thấy lá của các dịng chuyển gen có hình dạng, kích thƣớc và hàm lƣợng diệp lục tổng số bình thƣờng giống với lá của cây khơng xử lý mặn, ngƣợc lại lá của dòng WT bị uốn cong phần mép lá, kích thƣớc nhỏ lại và hàm lƣợng diệp lục tổng số giảm mạnh (hình 3.34 và 3.35).
Hình 3.34: Hình thái lá của dịng thuốc lá chuyển gen (TPC-T3) và đối chứng không
chuyển gen (WT) sinh trƣởng trên môi trƣờng xử lý 300 mM NaCl.
0mM 100mM 200mM 300mM
0mM 100mM 200mM 300mM
Dòng WT