VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4. Phƣơng pháp tạo cây thuốc lá chuyển gen (phƣơng pháp chuẩn đang đƣợc
sử dụng của Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học)
Bảng 2.7: Môi trƣờng nuôi và chọn lọc cây thuốc lá chuyển gen
Tên môi trƣờng Ký hiệu Thành phần môi trƣờng
Đồng nuôi cấy CT1 MS + 1mg/l BAP + 30g/l sucrose + 8g/l agar, pH=5,8
Chọn lọc chồi
chuyển gen CT2
MS + 1mg/l BAP + 30g/l sucrose + 8g/l agar + 500mg/l cefotaxime, 100mg/l kanamycin, pH=5,8 Ra rễ CT3 MS + 0,1mg/l NAA + 30g/l sucrose + 8g/l agar +
300mg/l cefotaxime + 50mg/l kanamycin, pH 5,8
i) Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens
Sau khi chọn lọc thành cơng các dịng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen, lấy một khuẩn lạc riêng biệt, phát triển tốt trên đĩa khuẩn cấy vào 10ml mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin 50mg/l và kháng sinh rifamycin 50mg/l, nuôi qua đêm ở 28o
C. Lấy 2ml dịch huyền phù chuyển sang 50ml LB lỏng (không bổ sung kháng sinh) nuôi phục hồi trong 4 giờ. Ly tâm 5.000v/p trong 10 phút ở 40C để thu cặn tế bào vi khuẩn. Sau đó, hịa tan cặn khuẩn trong mơi trƣờng ½ MS lỏng, pH = 5.8, đến mật độ khuẩn đạt giá trị OD600 = 0,7, để biến
nạp vào tế bào thực vật.
ii) Tạo nguyên liệu chuyển gen
Chọn các lá bánh tẻ, có kích thƣớc vừa phải ở cây con khỏe mạnh 2 tuần tuổi. Dùng dao cắt bốn cạnh mép lá gây tổn thƣơng, tạo thành các mảnh lá có kích
thƣớc khoảng 1x1cm. Sau đó, các mảnh lá này đƣợc đặt trong mơi trƣờng ½ MS lỏng trƣớc khi biến nạp để tránh bị khô.
iii) Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Ngâm các mảnh lá vào dịch huyền phù vi khuẩn, OD600 = 0,7 trong 10 phút, có lắc nhẹ. Mẫu cấy đƣợc thấm khô bằng giấy thấm khử trùng và đặt lên môi trƣờng đồng nuôi cấy CT1 trong tối 3 ngày.
iv) Sàng lọc chồi và cây thuốc lá chuyển gen trên mơi trƣờng có kháng sinh chọn lọc
Sau 3 ngày đồng nuôi cấy, đặt các mảnh lá lên giấy thấm khô hết dịch khuẩn và chuyển lên môi trƣờng CT2. Sau 3-4 tuần, xuất hiện các cụm chồi nhỏ từ mép các mảnh lá, tách các cụm chồi, tiếp tục cấy lên môi trƣờng CT2 mới. Đến khi các chồi thật phát triển từ các cụm chồi thì tiến hành tách từng chồi riêng rẽ và cấy lên môi trƣờng ra rễ CT3.