b) Các gen chỉ thị (reporter genes)
1.4.5. Chuyển gen gián tiếp vào cây trồng thông qua Agrobacterium
Khác với các phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp ở thực vật, phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp đƣợc thông qua một sinh vật trung gian mang gen cần chuyển. Những sinh vật này tiến hành q trình chuyển gen vào tế bào thực vật thơng qua các cơ chế rất tự nhiên. Một trong những phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp ở thực vật đƣợc sử dụng, nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến là phƣơng pháp chuyển gen thơng qua lồi vi khuẩn đất Agrobacterium. Từ đầu những năm 80, khi các nhà khoa học thành công trong việc sử dụng đoạn T-DNA của Ti – plasmid (Wang et al., 1984) để đƣa gen ngoại sinh thâm nhập vào hệ gen của tế bào thực vật thì việc chuyển gen thông qua Agrobacterium trỏ thành công cụ hữu hiệu trong công nghệ chuyển gen thực vật, kể cả cây hai lá mầm và một lá mầm (Hiei et al., 1994). Chuyển gen thông qua Agrobacterium dễ sử dụng, ít tốn kém nhƣng lại mang lại hiệu quả cao (lƣợng
bản sao gen biến nạp ít-tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và khơng gây tổn thƣơng tế bào). Theo cơ sở dữ liệu công bố trên các trang web về khoa học, các cơng trình khoa học cơng bố chuyển gen vào thực vật bằng phƣơng pháp gián tiếp nhờ Agrobacterium là 1038 trong giai đoạn từ 1985 – 1999 và tăng lên 3604 trong
giai đoạn từ 2000 – 2011 (Rivera et al., 2012).
Cơ chế của quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật của Agrobacterium
Vùng Vir bao gồm ít nhất 6 operon (VirA, VirB, VirC, VirD, VirG và VirE) và hai vùng không cơ bản (VirF, VirH). Số lƣợng gen trong một operon là khác nhau: VirA, VirG, VirF chỉ có một gen; VirE, VirC, VirH có hai gen; VirD, VirB có từ 4 -11 gen. Hai operon giữ chức năng cơ bản là VirA và VirG mã hoá cho hệ thống hai thành phần (VirA-VirG), hai thành phần này có vai trị hoạt hố q trình dịch mã của các gen Vir khác. Các protein mã hố từ gen Vir đóng vai trị chủ yếu
trong q trình chuyển gen của A. tumefaciens. Các vai trò này đã đƣợc thảo luận
trong nhiều tài liệu, ở đây chỉ nêu một số nét chính trong q trình vận chuyển đó. Protein VirA và protein VirG đóng vai trị là thành viên của hệ thống điều chỉnh di truyền hai thành phần mẫn cảm với tính hiệu vận chuyển. Đầu tiên là hoạt động của VirA, dấu hiệu để hoạt hoá VirA bao gồm pH axit, hợp chất phenol đƣợc tiết ra từ thực vật nhƣ acetosyringone và một vài loại monosacharide nhƣ glucose, galactose (Doty & Heath, 1996). Gen VirA hoạt động sinh ra protein VirA. Protein VirA tự photphorin hố và sau đó photphorin hố protein VirG. Dạng protein VirG khơng photphorin hố khơng có hoạt tính. Protein VirG bị photphorin hố có khả năng điều khiển sự biểu hiện các gen Vir khác.
Hoạt động của các gen Vir sinh ra sợi đơn T-DNA làm xuất hiện bản copy sợi bên dƣới của T-DNA. Chỉ đoạn sợi đơn DNA giữa hai trình tự biên (LB và RB) của T-DNA mới đƣợc chuyển vào tế bào thực vật, và đƣợc gắn vào genome của tế bào. Đó là các yếu tố hoạt động cis của hệ thống vận chuyển T-DNA. Protein VirD1, D2 đóng vai trị chìa khố trong bƣớc này, chúng nhận ra trình tự biên T- DNA và cắt sợi bên dƣới tại mỗi bên. Điểm cắt là điểm đầu và kết thúc của sợi tái sinh. Sau đó, protein VirD2 vẫn cịn gắn kết với đầu cuối 5’ của sợi T-DNA. Sự kết hợp ngăn cản enzyme exonuclease tấn công vào đầu 5’ của sợi đơn T-DNA (Durrenberger et al.,1998) và nhận ra đầu 5’ nhƣ là đầu dẫn đƣờng cho quá trình
chuyển T-DNA vào tế bào thực vật (Christie, 1997). Nếu gây đột biến hay loại bỏ đoạn RB thì hầu nhƣ mất hồn tồn khả năng chuyển T-DNA, cịn nếu làm biến đổi LB sẽ làm giảm hiệu quả chuyển T-DNA (Hille et al., 1983). Điều đó chứng tỏ tổng hợp sợi T-DNA là từ đầu 5’ đến 3’, đƣợc bắt đầu từ đoạn RB và kết thúc ở LB.
Phƣơng tiện để chuyển đoạn T-DNA vào nhân tế bào thực vật là phức protein và sợi T-DNA. Theo đa số các nhà khoa học cho rằng phức hợp sợi đơn T- DNA- VirD2 đƣợc bao bọc bởi protein VirE2 có trọng lƣợng 96 kDa. Sự phối hợp này giúp ngăn cản sự tấn công của nuclease, hơn nữa sợi đơn T-DNA duỗi thẳng làm giảm kích thƣớc của phức xuống xấp xỉ 2nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di truyển qua các kênh dẫn truyền trên màng tế bào (Gustavo & Cabrera,
1998b). Protein VirE2 chứa đựng 2 tín hiệu định vị trong nhân tế bào thực vật và một protein VirD2 (Bravo Angel et al., 1998). Thực tế cho thấy hai protein này có vài trị quan trọng trong việc dàn xếp sự hấp thụ phức vào trong nhân tế bào thực vật (Zupan et al., 1996). Nếu loại bỏ tín hiệu định vị trong nhân thì một trong các protein này bị giảm, nhƣng không ức chế hồn tồn q trình chuyển T-DNA và tƣơng tác giữa T-DNA với genome của tế bào thực vật, chứng tỏ có một thành viên khác có thể đảm nhận một phần tối thiểu vai trò của protein bị thiếu (Gustavo & Cabrera, 1998a). Protein VirE cần thiết đối với quá trình bài xuất protein VirE2 sang tế bào thực vật (Binns et al., 1995).
Các nghiên cứu công bố đã miêu tả vai trò của operon VirB có kích thƣớc 9,5 kb trong quá trình sản sinh cấu trúc bề mặt của tế bào đối với sự vận chuyển phức từ vi khuẩn sang tế bào thực vật (Stephens et al., 1995; Fernandez et al., 1996).
Protein VirD4 cũng là bắt buộc với sự vận chuyển phức ssT-DNA. Chức năng của protein VirD4 là liên kết với ATP độc lập với phức protein cần thiết với quá trình di truyền T-DNA. Protein VirB là protein có đặc tính kị nƣớc tƣơng tự protein kết hợp trên màng khác (Shirasu et al., 1994). Phần lớn protein VirB đã đƣợc phát hiện giống nhƣ kênh protein xuyên màng (Stephen et al., 1995). Tuy nhiên, cũng có thể vài protein VirB khác đƣợc phân phối lại trong quá trình phát sinh sinh vật và thực hiện chức năng của kênh kết hợp qua tế bào vận chuyển (Christie, 1997). Có thể có trƣờng hợp của protein VirB2, một protein có nguồn gốc thực hiện chức năng ngoại bào. VirB2 có dạng tiền protein trọng lƣợng 12kDa, nó phải trải qua quá trình hoạt hố để trở thành dạng protein chức năng có trọng lƣợng 7kDa (Jones et al., 1996). Protein Vir B4, B11 là các ATPase kỵ nƣớc cần thiết đối với hoạt động chuyển T-DNA. VirB11 cấu tạo nên các phần nhỏ hoà tan, trong thời gian ngừng hoạt động đƣợc giữ lại để kết hợp với màng nguyên sinh chất. Đây là tính chất khơng điển hình đối với dạng protein này và chứng tỏ có thể cùng tồn tại các dạng cấu tạo khác nhau trong cơ thể sống (Gustavo et al., 1998b). Protein VirB4 kết hợp chặt chẽ với màng nguyên sinh chất (Dang and Christie, 1997). Tổng hợp
protein VirB4 có liên quan đến sự tích luỹ và phân phối protein VirB3. Protein VirB7 đƣợc xem là dạng cấu tạo chủ yếu của bộ máy vận chuyển. Protein VirB7 tƣơng tác với dạng nhị phân VirB9 và có khả năng tạo đa phức (Gustavo et al., 1998b). Tổng hợp protein VirB9 và tích lũy ổn định của nó phụ thuộc vào dạng di nhị phân, điều đó chỉ ra rằng protein VirB9 có thể khơng ổn định và địi hỏi kết hợp với protein VirB7 (Anderson et al., 1996). Protein VirB2, VirB11 là thành phần cơ bản của bộ máy vận chuyển T-DNA từ tế bào vi khuẩn sang tế bào thực vật (Zhou & Christie, 1997).
Hình 1.9: Mơ hình chuyển gen vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens
Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật
Trong tế bào thực vật, phức ssT- DNA đƣợc đƣa qua màng nhân vào nhân. Hai protein đóng vai trị quan trọng trong bƣớc này là VirD2 và VirE2. Tín hiệu định vị trong nhân của VirD2 và VirE2 đóng vai trị chủ yếu. Protein VirD2 có chức năng xác định vị trí cho T-DNA trong nhân. Phức ssT-DNA là phức nucleoprotein lên đến 20Kb chứa một đầu 5’ gắn với protein VirD2. Nhƣng phức đƣợc bao bởi số lƣợng lớn phân tử VirE2 (xấp xỉ 600/20Kb T-DNA) và mỗi phức này có hai tín hiệu định vị trong
nhân. Hai tín hiệu này của VirE2 đóng vai trị quan trọng đối với việc nhận liên tục phức T-DNA của nhân, có khả năng kích thích mở lỗ màng nhân. Khả năng nhận phức của nhân đƣợc điều khiển bởi protein kết hợp tín hiệu định vị đặc trƣng trong nhân, protein này đƣợc tìm thấy trong tế bào chất của tế bào thực vật (Gustavo et al., 1998a).
Bƣớc cuối cùng trong quá trình vận chuyển T-DNA là sự tƣơng tác trong genom tế bào thực vật. Các phản ứng trong sự tƣơng tác T-DNA khơng có tính điển hình. Sự tƣơng tác này tìm thấy bởi sự tái tổ hợp khơng theo quy luật (Lehman et al., 1994). Theo cách nhìn nhận này việc cắt bỏ bớt base, nhƣ microhomologies, đƣợc cần đến đối với bƣớc lặp lại giữa cặp vận chuyển T- DNA với VirD2 và DNA thực vật. Sự tƣơng đồng này rất thấp và cung cấp đặc trƣng nhỏ nhất đối với quá trình tái tổ hợp bởi sự xác định vị trí của VirD2 để gắn kết (Gustavo et al., 1998 a,b). Ở trình tự gần kề hay đầu 3’ của T-DNA tìm thấy một vài sự tƣơng đồng nhỏ với DNA thực vật, kết quả ở sự tƣơng tác đầu tiên giữa sợi T-DNA và DNA thực vật là tạo lỗ hổng ở sợi 3’-5’ của DNA thực vật. Sau đó DNA thực vật đƣợc cắt ở vị trí đầu 3’ của lỗ hổng bởi endonuclease và nucleotide của đầu 5’ bắt cặp với VirD2 bởi một nucleotit trong đầu sợi (5’-3’) DNA thực vật. Phần 3’ nhô ra của T-DNA cũng nhƣ DNA thực vật thay thế bị phân huỷ bởi endonuclease hay 3’-5’ exonuclease. Đầu 5’ của T- DNA gắn với VirD2 còn đầu 3’ kia cặp đôi với DNA thực vật kéo dài từ bƣớc đầu của quá trinh tƣơng tác, nối liền với vết cắt trong sợi DNA dƣới của thực vật. Sự đƣa vào của sợi T-DNA trong sợi 3’-5’ của DNA thực vật đƣợc bổ sung, tình trạng xoắn sinh ra bởi vết cắt trong sợi đối ngƣợc đƣợc sản sinh.
Tình trạng này hoạt hố phản ứng sửa chữa của tế bào thực vật và sợi bổ sung đƣợc tổng hợp sử dụng để chèn dễ dàng sợi T-DNA nhƣ là sợi khuôn (Tinland et al., 1995, Gustavo et al., 1998 a,b). VirD2 có vai trị hoạt hố trong sự hồ hợp chính xác sợi T-DNA vào nhiễm sắc thể thực vật. Phóng thích protein VirD2 có thể cung cấp năng lƣợng chứa đựng trong các liên kết phosphodieste, nhƣ Tyr29 với nucleotit đầu tiên của sợi T-DNA, qui định đầu 5’ của sợi T-DNA để nối vào DNA thực vật. Khi protein VirD2 bị đột biến đƣợc vận chuyển gắn vào sợi T-DNA, quá trình tƣơng tác
với vị trí phù hợp với nucleotit ở đầu 5’ của sợi T-DNA khơng cịn (Tinland et al., 1995). Ngồi ra q trình chuyển T-DNA cịn có sự tƣơng tác với các protein do gen trên nhiễm sắc thể của Agrobacterium quy định và protein trong tế bào thực vật.