M –+ C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C
3.3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm
Các dịng cây Xoan ta chuyển gen dƣơng tính với PCR trồng trong bầu đất 1 tháng tuổi đƣợc xử lý bởi hạn nhân tạo (không tƣới nƣớc). Sau 10 ngày xử lý bởi hạn nhân tạo, các dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm và dịng cây đối chứng có phản ứng khác nhau với điều kiện hạn; Trong 72 dòng cây Xoan ta chuyển gen thu đƣợc 2 dịng có khả năng chịu hạn tốt nhất (dịng có ký hiệu: PX24 và PX30) so với các dòng chuyển gen khác và đối chứng cây không chuyển gen (WT). Hai dòng Xoan ta PX24 và PX30 sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng, ngƣợc lại các dòng
a b
Xoan ta chuyển gen cịn lại và đối chứng khơng chuyển gen lá bị héo rủ, rụng và ngừng sinh trƣởng sau 10 ngày xử lý bởi hạn nhân tạo. Các dịng cây Xoan ta chuyển gen có mức độ chống chịu khơ hạn khác nhau, điều này có thể do khả năng biểu hiện của gen biến nạp và phụ thuộc vào vị trí chèn vào hệ gen vật chủ hoặc số lƣợng bản sao của gen biến nạp.
Hình 3.9: Các dịng Xoan ta chuyển gen P5CSm và dòng WT
sau xử lý bởi hạn nhân tạo 10 ngày (khơng tưới nước).
Các dịng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm khi sống trong điều kiện môi
trƣờng bị khô hạn sẽ tăng cƣờng sinh tổng hợp proline, giúp tăng cƣờng áp suất thẩm thấu của tế bào. Để biết đƣợc chi tiết hơn, các mẫu lá của 3 dòng Xoan ta chuyển gen (PX24, PX30 và PX13) và dòng đối chứng (WT) đã đƣợc thu trƣớc và sau xử lý bởi hạn nhân tạo ở các khoảng thời gian 4, 6, 8 và 10 ngày. Các mẫu lá đƣợc tách chiết và xác định hàm lƣợng proline. Kết quả thu đƣợc cho thấy, sau khi xử lý bởi hạn nhân tạo, các mẫu lá có hàm lƣợng proline tăng rất mạnh so với trƣớc xử lý hạn ở cả 4 dòng cây Xoan ta đƣợc phân tích, đặc biệt ở các dòng Xoan ta chuyển. Sau 10 ngày xử lý bởi hạn nhân tạo, hàm lƣợng proline ở dòng cây đối chứng không chuyển gen tăng lên 1,89 lần (tƣơng ứng tăng từ 0,247 lên 0,468 mg/g lá tƣơi) so với trƣớc xử lý hạn, trong khi đó các dịng cây chuyển gen tăng 3,04 – 5,79 lần (cao nhất ở dòng PX24 tăng từ 0,318 lên 1,842 mg/g lá tƣơi và thấp nhất ở dòng PX13 tăng từ 0,279 lên 0,850 mg/g lá tƣơi) (bảng 3.10 và hình 3.10). Kết quả
này hồn tồn phù hợp với sự biểu hiện về hình thái, về khả năng chống chịu khơ hạn của các dịng Xoan ta chuyển gen và dịng WT sau 10 ngày khơng tƣới nƣớc (hình 3.12).
Bảng 3.10: Hàm lƣợng proline tích lũy trong các dịng Xoan ta chuyển gen và đối
chứng khi xử lý bởi hạn nhân tạo
Dòng Xoan ta
Hàm lƣợng proline (mg/g lá tƣơi) 10 ngày xử lý (H10) Tỉ tệ (%) tăng sau so với trƣớc xử lý (TH) TH H4 H6 H8 H10 WT 0,247 0,311 0,355 0,461 0,468 189,474 PX13 0,279 0,471 0,577 0,650 0,850 304,659 PX24 0,318 0,85 0,963 1,366 1,842 579,245 PX30 0,306 0,718 0,881 1,320 1,737 567,647
Hình 3.10: Hàm lƣợng proline tính lũy trong các khoảng thời gian gây hạn nhân tạo.
Ghi chú: TH: trước xử lý hạn; H4, H6, H8 và H10: thời gian gây hạn 4, 6, 8 và 10 ngày; WT: cây khơng chuyển gen; PX13, PX24, PX30: dịng chuyển gen P5CSm.
Hình 3.11: Sản phẩm RT-PCR từ mRNA của các dòng Xoan ta chuyển gen và đối chứng.
PX13, PX24, PX30 là dòng chuyển gen; WT là dịng đối chứng khơng chuyển gen: + đối
chứng dương chạy từ mẫu plasmid pBI101:: P5CSm.
+ PX13 PX24 PX30
Để đánh giá mức độ biểu hiện phiên mã của gen P5CSm, chúng tôi đã tiến
hành tách chiết mRNA của 3 dòng Xoan ta chuyển gen và 1 dịng đối chứng (WT) làm khn cho phản RT-PCR. Kết quả cả 3 dịng chuyển gen đều dƣơng tính với phản ứng RT-PCR, xuất hiện một bằng DNA kích thƣớc khoảng 1100 bp đúng với
kích thƣớc lý thuyết của cặp mồi, cịn dịng WT âm tính (Hình 3.11).
Hình 3.12: Biểu hiện hình thái của các dịng Xoan ta chuyển gen và dòng WT trƣớc và sau
xử lý hạn 10 ngày. Hình a trước xử lý hạn; hình b sau 10 ngày xử lý hạn; PX30, PX24 và
PX13 là các dòng cây Xoan ta chuyển gen; WT dịng cây đối chứng khơng chuyển gen.
Kết quả nghiên cứu thu đƣợc cho thấy, đã chuyển thành cơng gen P5CSm mã hóa cho enzyme pyrroline 5-carboxylate synthetase dƣới sự điều khiển của promoter cảm ứng hạn rd29A vào cây Xoan ta. Xử lý hạn nhân tạo 72 dòng cây Xoan ta chuyển gen thu đƣợc 2 dịng PX24 và PX30 có khả năng chống chịu tốt với điều kiện khô hạn. Đây sẽ là cơ sở để ứng dụng công nghệ chuyển gen trong tạo giống cây lâm nghiệp nói chung và cây Xoan ta nói riêng chống chịu tốt điều kiện môi trƣờng khô hạn. 3a PX24 PX30 PX13 WT PX24 PX30 PX13 WT b a