KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.1. Xác định nồng độ kanamycin thích hợp để sàng lọc Xoan ta chuyển gen
3.1.1.1. Nồng độ kanamycin thích hợp cho chọn lọc chồi
Trong các nghiên cứu chuyển gen vào thực vật, việc xác định đƣợc ngƣỡng kháng sinh chọn lọc thích hợp để chọn lọc đƣợc mơ, chồi và cây chuyển gen là khâu quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu suất chuyển gen. Mỗi lồi cây có khả năng mẫn cảm với nồng độ kháng sinh kanamycin khác nhau. Vì vậy, nếu nuôi mẫu trên mơi trƣờng chọn lọc có nồng độ kanamycin quá cao sẽ làm mẫu/tế bào đƣợc chuyển gen bị chết, hoặc bị ức chế không tái sinh. Ngƣợc lại, nếu nuôi mẫu trên mơi trƣờng chọn lọc có nồng độ kháng sinh thấp sẽ khó chọn lọc đƣợc chồi chuyển gen. Trong nghiên cứu này, thử khả năng mẫn cảm của đoạn thân cây mầm và mảnh lá mầm cây Xoan ta trên môi trƣờng tái sinh chồi MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin bổ sung các nồng độ 0, 25, 50, 100, 150 và 200 mg/l kanamycin.
Hình 3.1: Ảnh hƣởng của nồng độ kanamycin đến khả năng tái sinh chồi
Kết quả nghiên cứu thu đƣợc sau 4 tuần nuôi cấy, cho thấy trên các công thức môi trƣờng bổ sung kháng sinh chọn lọc, mẫu cấy khơng chuyển gen vẫn có khả năng tái sinh chồi với tỉ lệ cao, cụ thể là: với đoạn thân cây mầm 93,5; 81,2 và 48,2; với mảnh lá mầm 81,9; 62,9 và 39,1 tƣơng ứng với nồng độ 25, 50 và 100 mg/l kanamycin. Ở cơng thức mơi trƣờng có nồng độ kanamycin ≥ 150 mg/l hầu hết các mẫu cấy cả đoạn thân cây mầm và mảnh lá mầm khơng cịn khả năng tái sinh chồi (hình 3.1 và 3.2). Từ kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng sử dụng nồng độ 150 mg/l kanamycin là thích hợp cho chọn lọc chồi Xoan ta chuyển gen.
Hình 3.2: Đoạn thân và mảnh lá mầm ni trên mơi trƣờng có kanamycin.
A: 100 mg/l kanamycin, B: 150 mg/l kanamycin
3.1.1.2. Nồng độ kanamycin thích hợp cho chọn lọc cây Xoan ta chuyển gen
Các chồi tái sinh đƣợc trên môi trƣờng bổ sung nhân tố chọn lọc (150 mg/l kanamycin) nhƣng không phải tất cả các chồi này là chồi chuyển gen. Vì việc tái sinh chồi bất định từ mơ sẹo thƣờng là cụm chồi nên chỉ cần có một chồi chuyển gen các chồi không chuyển gen vẫn có thể sống sót. Một số kết quả nghiên cứu về chuyển gen vào cây thuốc lá, cà chua, đậu tƣơng, cho thấy những chồi tái sinh và ra rễ đƣợc trên mơi trƣờng có nhân tố chọn lọc 100% là chồi chuyển gen. Tuy nhiên, đối với mỗi loại cây trồng khả năng ra rễ bị mẫn cảm với giới hạn nồng độ kháng sinh (kể cả cây chuyển gen). Nếu chồi chuyển gen nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung nồng độ kháng sinh quá cao thì chồi cũng bị ức chế ra rễ, vì vậy cần xác định đƣợc
nồng độ kháng sinh kanamycin thích hợp để chồi chuyển gen ra rễ cịn chồi khơng chuyển gen bị ức chế không ra rễ. Kết quả nghiên cứu ra rễ chồi Xoan ta trên môi trƣờng bổ sung 4 nồng độ kanamycin khác nhau (25, 50, 75 và 100 mg/l) thu đƣợc ở bảng 3.1 cho thấy, trên môi trƣờng ra rễ không bổ sung kháng sinh tỉ lệ chồi không chuyển gen ra rễ đạt 100%; môi trƣờng bổ sung 25 mg/l kanamycin tỉ lệ chồi không chuyển gen ra rễ đạt 46,1%, cịn trên mơi trƣờng bổ sung ≥ 50 mg/l kanamycin 100% chồi không chuyển gen bị ức chế ra rễ. Từ kết quả nghiên cứu này gợi ý sử dụng nồng độ 50 mg/l kanamycin là thích hợp để chọn lọc chồi chuyển gen Xoan ta ở giai đoạn ra rễ.
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của nồng độ kanamycin đến khả năng ra rễ chồi Xoan ta
kanamycin (mg/l) Lơ thí nghiệm Số chồi Thí nghiệm Số chồi ra rễ Tỉ lệ (%) Tỉ lệ TB (%) ± SD 0 1 15 15 100 2 20 20 100 100 ± 0,0 3 18 18 100 25 1 32 15 46,9 2 28 12 42,9 46,1 ± 2,9 3 35 17 48,6 50 1 35 0 0,0 2 30 0 0,0 3 30 0 0,0 75 1 25 0 0,0 2 20 0 0,0 3 32 0 0,0 100 1 15 0 0,0 2 20 0 0,0 3 20 0 0,0