Đánh giá chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm

3.2 .Chỉ tiêu hóa sinh

3.2.1 .Xác định hàm lượng chất béo

6.4. Đánh giá chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm

6.4.1. Đánh giá chỉ tiêu E.coli

- Lấy mẫu và xử lí mẫu : Cân 50g mẫu vào bình trộn tốc độ cao hoặc thể dùng máy xay sinh tố cỡ nhỏ, khử trùng nƣớc nóng và sau đó là cồn cho mỗi lần sử dụng ở các mẫu khác nhau. Cịn nếu khơng, có thể sử dụng mẫu bỏ vào túi nilong, dùng búa đập nhẹ để trộn mẫu - Dụng cụ, thiết bị:  Nồi cách thủy.  Nhiệt kế kiểu nhúng.  Tủ ấm.  Cân: Có thể cân chính xác đến 0,1g.

 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 1mg.

 Bình trộn.

 Máy trộn Vortex.

 Pipet chia vạch.

 Thiết bị khử trùng để xử lý mẫu.

 Chai pha loãng: Bằng thủy tinh borosilicat, có nút hoặc nắp vặn bằng polyetylen với vịng đệm teflon. Có thể sử dụng các chai pha lỗng chứa dung dịch đệm phosphat Butterfield có bán sẵn trên thị trƣờng.

 Thiết bị đếm khuẩn lạc.

 Thiết bị đo pH.

 Vịng cấy.

 Ống nghiệm: Kích thƣớc 13 mm x 100 mm. - Hóa chất:

 Canh thang lauryl tryptose (LST):

 Canh thang brilliant green-lactose-mật (BGLB)

 Canh thang EC

 Thạch eosin Levine-metylen xanh (L-EMB)

 Thạch đếm đĩa (PCA)

 Canh thang trypton (tryptophan)

 Canh thang MR-VP

 Canh thang xitrat Koser

 Thuốc thử Kovacs: 0.4ml

 Các thuốc thử Voges-Proskauer (VP)

 Dung dịch đệm phosphat Butterfield: 450ml

 Chất chỉ thị metyl đỏ: 3ml

 Thuốc nhuộm Gram: 5ml

 Creatin, dạng tinh thể. - Cách tiến hành:

 Thêm 450ml dung dịch đệm phosphat Butterfield vô trùng vào mẫu đã chuẩn bị và trộn trong 2 phút. Nếu chỉ có <50g mẫu thì cân phần mẫu thử tƣơng đƣơng với một nửa lƣợng mẫu và thêm thể tích dung dịch đệm sao cho có dung dịch pha lỗng 1:10.

 Chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân bằng dung dịch pha lỗng phosphat Butterfield vơ trùng. Số dung dịch pha loãng cần chuẩn bị phụ thuộc vào mật độ

E.coli dự kiến. Lắc tất cả huyền phù 25 lần với biên độ 30cm hoặc dùng máy trộn Vortex

trong 7giây. Khơng dùng pipet để phân phối thể tích nhỏ hơn 10% dung tích. Chuyển 1ml phần mẫu thử vào ba ống đựng canh thang LST đối với mỗi độ pha loãng đối với it nhất ba độ pha lỗng liên tiếp. Giữ pipet với góc sao cho pipet thấp hơn cạnh dƣới đối diện của ống. Để pipet chảy trong 2 giây đến 3 giây. Thời gian từ khi trộn mẫu đến khi kết thúc cấy mẫu là không quá 15 phút.

 Ủ các ống ở 35°C trong tủ ấm. Kiểm tra sự sinh khí của các ống sau 24giờ ± 2giờ, về sự thay đổi môi trƣờng trong ống Durham do lên men hoặc sự sủi bọt khi các ống đƣợc khuấy nhẹ. Ủ thêm các ống âm tính trong 24 giờ. Kiểm tra và ghi lại phản ứng sau 48 giờ ± 2 giờ. Thực hiện phép thử khẳng định trên tất cả các ống dƣơng tính giả định (có sinh khí).

 Bƣớc 2: Phép thử khẳng định E.Coli

 Từ mỗi ống LST sinh khí trong phép thử giả định, chuyển một vòng cấy chứa đầy huyền phù vào ống đựng canh thang EC. Ủ các ống EC trong 24 giờ ± 2 giờ ở 45,5°C trong nồi cách thủy và kiểm tra sự sinh khí. Nếu âm tính thì ủ lại và kiểm tra ở 48 giờ ± 2 giờ.

 Ống nghiệm thu đƣợc có sinh khí sau khi ủ 48 giờ ± 2 giờ ở 45,5°C đƣợc coi là dƣơng tính với E. coli.

 Bƣớc 3: Phép thử cuối cùng đối với E.Coli:

 Khuấy nhẹ mỗi ống EC sinh khí và đánh dấu đề phân lập, đƣa một vòng cấy vào đĩa thạch L-EMB và ủ trong tủ ấm trong thời gian từ 18 giờ đến 24 giờ ở 35°C. Kiểm tra các đĩa nghi ngờ chứa các khuẩn lạc E. coli, là các khuẩn lạc có tâm tối màu, có hoặc khơng có ánh kim loại. Chuyển năm khuẩn lạc nghi ngờ từ mỗi đĩa L-EMB sang thạch nghiêng PCA, ủ trong thời gian từ 18 giờ đến 24 giờ ở 35°C và dùng cho thử nghiệm tiếp theo.

 Nếu nhận diện đƣợc bất kì một trong năm khuẩn lạc là E. coli là đủ để coi ống EC dƣơng tính; vì vậy, khơng nhất thiết thử cả năm khuẩn lạc.

 Tiến hành nhuộm Gram để xem hình thể. Kiểm tra các tính chất sinh hóa sau đây (bốn phép thử đầu tiên gọi chung là IMViC) đối với các vi khuẩn hình que ngắn hoặc hình cầu bắt màu Gram âm.

 Khả năng sinh indol: Cấy vi khuẩn vào canh thang trypton và ủ 24 giờ ± 2 giờ ở 35°C. Kiểm tra việc sinh indol bằng cách thêm từ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử Kovacs. Phép thử dƣơng tính nếu xuất hiện màu đỏ đặc trƣng ở lớp phía trên.

 Phản ứng Voges-Proskauer: Cấy vi khuẩn vào canh thang MR-VP và ủ 48 giờ ± 2 giờ ở 35°C. Chuyển 1ml vào ống 13mm x 100mm. Thêm 0,6ml dung dịch alpha- naphthol trong etanol cùng với 0,2ml dung dịch kali hydroxit 40% và trộn. Thêm vài tinh thể creatine. Lắc và để yên trong 2 giờ. Phép thử dƣơng tính nếu xuất hiện màu hồng eosin.

 Phản ứng với metyl đỏ: Ủ ống MR-VP thêm 48giờ ± 2giờ ở 35°C sau phép thử Voges-Proskauer. Thêm 5 giọt dung dịch metyl đỏ vào mỗi ống. Phép thử dƣơng tính nếu có màu đỏ đặc trƣng. Phép thử âm tính nếu xuất hiện màu vàng.

 Sử dụng xitrat: Cấy nhẹ vào canh thang xitrat Koser; tránh làm đục ống. Ủ 96giờ ± 2giờ ở 35°C. Nếu canh thang đục là phản ứng dƣơng tính.

 Sinh khí từ lactose: Cấy vào canh thang LST và ủ 48 giờ ± 2 giờ ở 35°C. Nếu có bọt khí trong ống Durham thì phản ứng dƣơng tính.

Thay vì thực hiện các phép thử IMViC, có thể dùng các phép thử sinh hóa dùng dải vật liệu chuẩn bị sẵn. Cấy vi khuẩn trên thạch nghiêng PCA để thực hiện phép thử.

 Tất cả chủng cấy đƣợc coi là E. coli nếu:

 Lên men lactose có sinh khí trong 48 giờ ở 35 °C,

 Xuất hiện dƣới dạng hình que ngắn hoặc hình cầu khơng sinh bào tử, bắt màu Gram âm, và

 Cho IMViC (bốn phép thử đầu tiên) kiểu ++-- (dạng sinh học 1) hoặc -+-- (dạng sinh học 2).

- Tính tốn kết quả: Để kết quả có giá trị, thƣờng cần đếm các khuẩn lạc trên ít nhất một đĩa có chứa ít nhất 10 khuẩn lạc (Tổng số các khuẩn lạc, khuẩn lạc điển hình hoặc các khuẩn lạc phù hợp với các tiêu chí xác định). Tính số lƣợng N vi sinh vật có trong mẫu thử theo trung bình khối lƣợng từ hai độ pha loãng liên tiếp bằng cách sử dụng Công thức:

∑

Trong đó:

 C: Là tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên hai đĩa đƣợc giữ lại từ hai độ pha lỗng liên tiếp, trong đó ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc;

 V: Là thể tích chất cấy đƣợc đƣa vào mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml);

 D: Là độ pha loãng tƣơng ứng với dung dịch pha loãng đầu tiên đƣợc giữ lại. Nếu có nhiều hơn một độ pha loãng đƣợc sử dụng, tỷ lệ giữa số đếm khuẩn lạc của dung dịch pha loãng d2 và số đếm khuẩn lạc của dung dịch pha loãng d1 dự kiến là 10%.

6.4.2 Đánh giá chỉ tiêu S.aureus

- Lấy mẫu và xử lí mẫu:

Cân một cách vô trùng khoảng 50g mẫu thử chƣa rã đông cho vào bình trộn vơ trùng. Thêm 450 ml dịch pha loãng đệm phosphat và đồng hóa trong 2 phút ở tốc độ cao (từ 16

000 vòng/phút đến 18 000 vòngphút). Sử dụng dịch pha loãng 1:10 này để chuẩn bị các dãy dịch pha loãng từ 10-2 đến 10-6 bằng cách chuyển 10ml pha loãng 1:10 vào 90 ml dịch pha loãng trắng, lắc mạnh để trộn kỹ và tiếp tục cho đến khi thu đƣợc dịch pha loãng 10-6.

- Dụng cụ, thiết bị:

 Pipet.

 Bộ trộn.

 Máy trộn, Vortex Genie hoặc loại tƣơng đƣơng.

 Nồi cách thủy.

 Tủ ấm.

 Tủ sấy.

 Bộ đồng hóa.

 Que cấy vòng và que cấy hoặc đũa thủy tinh, hoặc vịng cấy hoặc kim cấy vơ trùng sử dụng một lần.

- Hóa chất: (Xem thành phần và cách pha tại TCVN 5518-1:2007)

 Dịch pha loãng ( nƣớc đệm pepton (BPW)): 10ml

 Dịch pha loãng đệm phosphat: 450ml

 Môi trƣờng nuôi cấy: 90ml

 Thuốc thử oxidaza

 Canh thang BHI: 0,5ml

 Huyết tƣơng coagulaza có EDTA: 0,5ml - Cách tiến hành:

+ Bƣớc 1: Kỹ thuật tính số có xác suất lớn nhất

 Cấy vào 3 ống đựng canh thang trypticaza đậu tƣơng với NaCl 10% và natri pyruvat 1% ở mỗi độ pha loãng với các lƣợng 1 ml của dịch pha loãng thập phân. Cần có đủ độ pha lỗng từ phần mẫu thử để có đƣợc điểm kết thúc âm tính. Ủ ấm trong 48 giờ ở 35oC.

 Sử dụng vòng cấy 3mm, chuyển 1vòng cấy từ mỗi ống phát triển dƣơng tính sang các đĩa đựng mơi trƣờng Baird-Parker khô. Trộn các ống trên máy trộn Vortex trƣớc khi ria cấy nếu chỉ thấy mọc ở trên đáy hoặc bên thành ống. Ria cấy sao cho thu đƣợc các khuẩn lạc mọc tách biệt. Ủ 48 giờ ở 35oC đến 37oC.

 Bƣớc 2: Khẳng định :

 Đối với mỗi ống cho thấy có sự phát triển, lấy 1 hoặc nhiều hơn các khuẩn lạc nghi ngờ là S. aureus. Dùng kim cấy vô trùng chuyển các khuẩn lạc sang các ống chứa

0,2ml canh thang BHI và các mặt nghiêng của thạch chứa mơi trƣờng duy trì thích hợp bất kỳ, ví dụ nhƣ thạch trypticaza đậu tƣơng thạch đếm đĩa chuẩn, v.v… Giữ lại các chủng cấy trên ống thạch ở nhiệt độ phòng để dự phòng, hoặc lặp lại phép thử trong trƣờng hợp các kết quả thu đƣợc có nghi ngờ.

 Cho 0,5ml huyết tƣơng coagulaza có EDTA hồn ngun vào dịch cấy BHI và trộn kỹ. Ủ ấm ở nhiệt độ từ 35oC đến 37oC và cứ sau 6 giờ kiểm tra sự kết đông. Bất kỳ sự kết đông nào cũng đƣợc coi là phản ứng dƣơng tính. Các cục kết đơng nhỏ hoặc thƣa có thể quan sát đƣợc bằng cách gõ nhẹ ống sao cho phần chất lỏng của hỗn hợp phản ứng chạm tới miệng ống, các cục đơng sẽ lộ ra phía trên bề mặt chất lỏng. Các chủng dƣơng tính coagulaza đƣợc coi là S. aureus. Các phép kiểm chứng âm tính và dƣơng tính phải

đƣợc thực hiện đồng thời với các chủng cấy của khả năng phản ứng coagulaza chƣa biết. Kiểm tra lại các kết quả thử nghiệm coagulaza nghi ngờ trên các chủng cấy BHI đã đƣợc ủ ấm ở 35oC đến 37o

C từ 18 giờ đến 48 giờ. - Tính tốn kết quả:

 Các khuẩn lạc của S. aureus điển hình trịn, trơn nhẵn, lồi, ƣớt, có đƣờng kính từ 2mm đến 3mm trên các đĩa mọc thƣa, có màu đen xám đến đen nhánh, thƣờng có viền sáng màu (khơng trắng), có quầng đục bao quanh (kết tủa) và thƣờng có vùng trong phía ngồi; các khuẩn lạc dính khi tiếp xúc với kim cấy. Đơi khi có thể gặp phải các chủng khơng phân giải lipit có vẻ bề ngồi tƣơng tự, ngoại trừ khơng có quầng đục bao quanh và các vùng sang. Các khuẩn lạc đƣợc phân lập từ các loại thực phẩm khô hoặc đông lạnh đã đƣợc bảo quản trong khoảng thời gian dài thƣờng ít đen hơn các khuẩn lạc điển hình và có thể có dạng bên ngồi thơ nhám và cấu trúc khơ.

 Tính số có xác suất lớn nhất (MPN) của S. aureus trên gam sản phẩm từ bảng 18 phần A.